呼吸道合胞病毒NS1基因原核表达及其免疫原性分析

目的:原核表达呼吸道合胞病毒(RSV)非结构NS1蛋白,并对其免疫特性进行研究.方法 采用PCR技术获得NS1基因,将其插入pET41a(+)载体上,导人大肠杆菌后诱导表达;利用GST亲和层析柱对诱导表达的NS1蛋白进行纯化,免疫动物制备抗体,Western blot法鉴定抗体的特异性.结果 重组质粒经酶切鉴定和DNA序列测序完全正确,经IPTG诱导后融合蛋白在大肠杆菌BL21-DE3中得到高效表达,表达产物经超声破碎和GST亲和层析纯化获得重组蛋白,分子量约42 000 Mr,以抗NS1蛋白的多克隆抗体为一抗进行Western blot检测,结果只有RSV感染细胞的样品在15 000 Mr处有特异性带显示,其他病毒感染的细胞和阴性对照没有相应条带.结论 NS1基因得到高效表达,免疫制备得到的抗体与RSV感染细胞有特异性反应,与其他常见呼吸道病毒感染细胞无交叉免疫反应.     

呼吸道合胞病毒NS1基因原核表达及其免疫原性分析

目的：原核表达呼吸道合胞病毒（RSV）非结构NSl蛋白,并对其免疫特性进行研究。方法采用PCR技术获得NS1基因,将其插入pET41a（＋）载体上,导人大肠杆菌后诱导表达;利用GST亲和层析柱对诱导表达的NS1蛋白进行纯化,免疫动物制备抗体,Westernblot法鉴定抗体的特异性。结果重组质粒经酶切鉴定和DNA序列测序完全正确．经IPTG诱导后融合蛋白在大肠杆菌BL21-DE3中得到高效表达．表达产物经超声破碎和GST亲和层析纯化获得重组蛋白,分子量约42000Mr,以抗NS1蛋白的多克隆抗体为一抗进行Westernblot检测,结果只有RSV感染细胞的样品在15000Mr处有特异性带显示,其他病毒感染的细胞和阴性对照没有相应条带。结论NSl基因得到高效表达,免疫制备得到的抗体与RSV感染细胞有特异性反应,与其他常见呼吸道病毒感染细胞无交叉免疫反应。     

重组人3型腺病毒六邻体蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备抗人3型腺病毒六邻体蛋白的单克隆抗体并对单抗进行鉴定.方法 用纯化的重组六邻体蛋白免疫BALB/c小鼠.取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合.经ELISA间接法筛选和克隆化培养,获得4株分泌抗腺病毒六邻体蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,纯化其腹水获得单抗.使用ELISA、Western blot和中和实验等方法鉴定单抗的敏感性、特异性以及中和活性.结果 ELISA和免疫印迹结果表明这4株单抗与腺病毒六邻体蛋白可以特异性结合.而且,4C6株单抗具有中和活性.结论 获得了4个单抗为腺病毒六邻体蛋白的单克隆抗体,可用于3型腺病毒的早期诊断和药物治疗的研究.     

香雪抗病毒口服液体外抗甲型流感病毒及炎症因子的作用机制研究

目的 探讨香雪抗病毒口服液对甲型流感病毒的活性及其在炎症免疫应答中的潜在作用机制。方法 采用噻唑蓝（MTT）染色法检测香雪抗病毒口服液对MDCK细胞和A549细胞的细胞毒性作用。采用细胞病变抑制法（CPE）及空斑减少实验对香雪抗病毒口服液进行抗病毒活性检测。采用免疫荧光法检测NP蛋白。实时荧光定量PCR测定炎症细胞因子的表达情况。采用蛋白印迹实验检测香雪抗病毒口服液对炎症相关信号通路的蛋白表达的影响。结果 香雪抗病毒口服液对甲型流感病毒A/PR/8/34（H1N1）和A/Aichi/2/68（H3N2）均有一定的抗病毒抑制作用，半数细胞毒性浓度（TC₅₀）分别为42.12、79.36 mg/mL，半数抑制浓度（IC₅₀）分别为8.665、5.260 mg/mL，并可减少H1N1病毒空斑形成。香雪抗病毒口服液能呈剂量相关性地降低H1N1诱导的A549细胞炎症因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、视黄酸（维甲酸）诱导基因蛋白I （RIG-I）、趋化因子（CC基序）配体5（CCL5）、巨噬细胞炎症蛋白-1β（MIP-1β）、干扰素诱导蛋白-10（IP-10）、白细胞介素-10（IL-10）、λ干扰素（IFN-λ）、β干扰素（IFN-β）、白细胞介素-8（IL-8） mRNA的表达（P<0.05、0.01、0.001）。在流感病毒单复制周期中，香雪抗病毒口服液在早期阶段0~2 h干预，具有良好的抗流感病毒效果。香雪抗病毒口服液能显著抑制Toll样模式识别受体3（TLR3）、RIG-I、黑色素瘤分化相关基因5（MDA-5）受体的表达，下调核转录因子-κB亚基p65（NF-κB p65）、NF-κB抑制蛋白α（IκBα）、信号转导和转录激活因子1（STAT1）、STAT2、STAT3的磷酸化水平，且在20 mg/mL浓度下明显下调这些蛋白的表达。结论 香雪抗病毒口服液不仅能有效抑制甲流感病毒在人宿主细胞中复制，降低流感病毒诱导的炎症因子表达，而且能显著抑制流感病毒诱导天然免疫信号通路的相关蛋白表达，表明香雪抗病毒口服液具有防治流感病毒的潜力。