利用PCR技术构建GM-CSF/Fc_(γ2)~-融合蛋白真核表达载体

目的　对融合基因GM -CSF Fcγ2 进行定点突变 ,去除其补体结合位点 ,构建GM -CSF Fcγ2-融合蛋白真核表达载体。方法　通过设计突变引物 ,利用PCR定点突变技术扩增融合基因GM -CSF Fcγ2-。并通过T -A克隆策略 ,把突变后的融合基因GM -CSF Fcγ2-重组到真核表达载体pRc CMV2中 ,构建真核表达质粒pRc CMV2 GM -CSF Fcγ2-并经过酶切和测序确证。结果　成功对融合基因GM -CSF Fcγ2-进行了突变 ,构建了真核表达载体pRc CMV2 GM -CSF Fcγ2-。结论　利用该PCR方法进行基因定点突变可行     

膜结合型肿瘤坏死因子在人乳腺癌细胞中的转染

目的 :研究膜结合型肿瘤坏死因子α(TNFα)在基因转染中的特点及其在肿瘤基因治疗中的作用等特性。方法 :用反转录病毒为载体 ,将含有突变的膜结合型TNFα的质粒 ,用lipofectin法转入包装细胞株crip细胞。又用收集到的病毒上清感染人乳腺癌细胞MDA2 31,采用G418筛选 ,DNA印迹法和聚合酶链反应方法鉴定该基因转染的结果。结果 :经上述方法鉴定表明该外源基因已成功转染人乳腺癌细胞中 ,为进一步研究膜结合型TNFα的功能奠定了基础。结论 :经初步研究表明 ,含有膜结合型肿瘤坏死因子的质粒可以通过lipofectin法成功导入crip细胞 ,且该病毒可成功感染人乳腺癌细胞并整合     

两株人乳癌细胞系的建立及其生物学特性的研究

由裸鼠异种接种成功,并经4次传代的两份不同来源的人乳癌组织中分离培养出两株在体外能长期传代培养的人乳癌细胞系.分别命名这两株细胞系为:BICR-y-9601和BI-CR-y-9602.核型分析表明,所有的染色体均为人染色体.BICR-y-9601细胞的染色体数为亚二倍体,其中63%的细胞染色体数在44～5O之间,其中染色体为48条的细胞最多.BICR-y-9602细胞的染色体数为亚三倍体,80%的细胞具有50～58条染色体.该两株细胞表现出不同的生物学特性,其中BICR-y-9601细胞主要为半贴壁生长的圆球型细胞,其倍增时间为25小时.BICR-y-9602细胞为贴壁生长的多形性的细胞,其倍增时间为30小时.同时,我们用FACS分析了这两株细胞所处的细胞周期的情况.扫描电镜结果显示这两     

T淋巴瘤TOCRVβ核酸疫苗的构建和生物学活性的初步检测

T淋巴瘤是某种重排的T细胞恶性增殖的结果,这种恶性增殖T细胞上特异的TCR可以看作肿瘤特异性或相关抗原.本研究目的是制备T淋巴瘤TCRVβ核酸疫苗,诱导机体产生针对恶性增殖的T细胞克隆的免疫反应.从人T淋巴瘤细胞Jurkat中提取总RNA.合成cDNA.根据Jurkat细胞TCRVβ的基因序列设计引物,用PCR扩增TCRVβ的基因片段.PCR产物和表达载体pcDNA3经KpnⅠ和BamHⅠ双酶切后,回收酶切片段,用T_4 DNA连接酶连接.连接产物转化E.Coli DH5a,筛选阳性克隆,提取质粒,进行双酶切鉴定.大量提取双酶 切鉴定为正确的重组载体pcDNA3-TCRVβ,PEC法纯化后测序.用磷酸钙沉淀法将重组载体转染SP2/0细胞,24h后加200μg/ml G418筛选培养,挑取阳性克隆扩     

EBV转化技术中小鼠腹腔巨噬细胞的作用

EBV转化—融合技术是制备人单克隆抗体(McAb)的重要途径之一。但是,EBV转化技术的难点是在转化后,由于同时被EBV激活的特异性记忆T细胞的细胞毒作用,B细胞     

利用PCR技术构建GM—CSF／Fcγ2融合蛋白载体

目的：构建 Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ／ Ｆｃγ２ 融合蛋白载体。方法：利用 Ｐ Ｃ Ｒ技术,将人 Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ基因与人免疫球蛋白 Ｉｇ Ｇ２ 的 Ｆｃ 段基因联接,构建融合基因ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ Ｈ Ｖ２;并将此片段定向克隆到真核表达质粒ｐ Ｒｃ／ Ｃ Ｍ Ｖ２ 载体。结果：琼脂糖凝胶电泳结果显示 Ｐ Ｃ Ｒ扩增出了 １．３ ｋｂ 的融合基因片段;限制性内切酶图谱分析,成功地完成了 Ｇ Ｍ  Ｃ Ｓ Ｆ／ Ｆｃγ２ 融合蛋白载体的构建。结论：（１）经 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增技术由质粒 Ｐ Ｃ Ｄｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ和 Ｐ Ｓ Ｖ Ｖ Ｎ Ｐ Ｈ Ｖ２ 分别扩增到了所需的ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ ｃ Ｄ Ｎ Ａ 片段和 Ｉｇ Ｇ２ 从绞链区到 Ｃ Ｈ３ 的基因组 Ｄ Ｎ Ａ 片段。（２）利用 Ｐ Ｃ Ｒ介导,扩增出了融合基因片段ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ Ｈ Ｖ２。（３）构建了真核细胞表达载体ｐ Ｒｃ／ Ｃ Ｍ Ｖ２／ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ Ｈ Ｖ２ 。     

免疫粘附素:一种新的研究和生物治疗工具——GM-CSF/Fc_(γ2)融合蛋白载体的构建与表达

粒细胞集落刺激因子和粒细胞-巨噬细胞等集落刺激因子是肿瘤病人化疗后提高机体造血和免疫功能所必须的药物,但由于各种集落刺激因子在体内的半衰期极短,因此须使用较大的剂量,而这又将产生明显的毒副作用.延长这些集落刺激因子在体内的半衰期,减少其用量有可能减轻毒副作用.免疫粘附素(Immunoadhesin)由于其特有的生物学活性,是近年来受人瞩目的一种新的研究和生物治疗工具.     

膜结合型肿瘤坏死因子在人乳腺癌细胞中的表达及其对肿瘤细胞生长的影响

肿瘤坏死因子(TNFL-α)具有较强的抗肿瘤作用.膜相关的肿瘤坏死因子(MA-TNF-α)同样具有抑制肿瘤生长的作用.由于MA-TNF-α仅在局部微环境中起作用,因此没有全身性的毒副作用.为了观察MA-TNF-α对肿瘤的作用,本研究将含突变的MA-TNF-α基因的逆转录病毒载体导入包装细胞系,以其产生的病毒上清感染人乳癌细胞MDA231研究了外源基因在靶细胞中的整合与表达,并通过体外杀伤及裸鼠体内致瘤性实验观察了其抗肿瘤效应.基因转导后生成的产病毒细胞产生的病毒上清能有效转染MDA231细胞(转导后的细胞称为MDA231T).提取细胞基因组DNA行PCR分析     

膜结合型TNF-α基因在人胃癌细胞中的表达及其对肿瘤细胞生长的影响

TNF-α是一种具有抗肿瘤作用的细胞因子．它有二种形式，一种是26kD膜结合型，另一种是17kD分泌型，二者在体外均有细胞毒活性。我们利用逆转录病毒载体LXSN构建了插入突变的膜结合型TNF-α基因的重组逆转录病毒载体。用Lipofectin将逆转录病毒载体及重组逆转录病毒载体引入包装细胞CRIP，