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目的:研究利用低剂量腺病毒提高重组腺相关病毒2型(recombined adeno-associated virus,rAAV2)在耐药与非耐药肿瘤细胞中基因表达水平的新方法,并初步探讨其可能的作用机制。方法:rAAV2-GFP单独或联合复制缺陷型腺病毒(Ad5-RFP)或条件复制型腺病毒(Ad5-TERT-RFP)感染人非小细胞肺癌细胞系(NCI-H446)、人肺腺癌细胞系(A549)、人胃癌细胞系(SGC7901)、人口腔黏膜上皮癌细胞系(KB)和人口腔黏膜上皮癌耐长春新碱细胞系(KB/VCR)。荧光显微镜观察和流式细胞仪分析肿瘤细胞感染后GFP的表达;Western blotting检测感染后肿瘤细胞GFP蛋白表达及ERK和AKT磷酸化水平;Real-time PCR检测肿瘤细胞内GFP的mRNA表达量、DNA拷贝数,以及细胞表面受体HSPG、α_v integrin和FGFR-1的mRNA表达。结果:流式细胞结果显示,rAAV2-GFP联合Ad5-RFP或Ad-TERT-RFP感染肿瘤细胞24h后,GFP阳性细胞率和GFP平均荧光亮度分别提高了约0.3~3倍和4~8倍。Western blotting证实联合应用Ad5-RFP感染肿瘤细胞后24h,GFP蛋白表达增加约4~6倍,肿瘤细胞内ERK和AKT磷酸化水平升高。联合感染后细胞内GFP的mRNA表达量提高了3.83~7.33倍,DNA拷贝数未见明显改变,HSPG、α_v integrin和FGFR-1的mRNA表达轻微提高。结论:低剂量腺病毒显著提高rAAV2在耐药与非耐药肿瘤细胞中的基因表达水平,可能与激活信号传导通路、增加细胞内转录有关。 相似文献
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目的构建含乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因的重组腺相关病毒(rAAV)并观察目的基因的表达和功能。方法采用PCR法从PTHBV-1质粒中扩增HBsAg基因(ayw 亚型);将PCR扩增产物插入腺相关病毒(AAV)表达质粒pSNAV中,构建重组质粒pSNAV-HBsAg;用脂质体转染的方法将重组质粒转入BHK-21细胞中,G418筛选得到转入重组质粒并能表达目的基因的细胞系BHK-HBsAg;用具有rAAV包装功能的HSV-1- HSV1-rc/△UL2感染BHK-HBsAg,纯化后得到rAAV-HBsAg;ELISA检测重组病毒表面抗原基因在BHK-21细胞和293细胞中的表达;用rAAV-HBsAg免疫BalB/C小鼠,RIA法检测血清中表面抗体的滴度。结果ELISA法检测到混合细胞系BHK-HBsAg中HBsAg的表达量为(28.6±6.7)ng/5×106细胞;rAAV-HBsAg感染BHK-21细胞和293细胞后均能检测到HBsAg的表达,表达量随感染复数的增加而升高;rAAV-HBsAg免疫的BalB/C小鼠能产生表面抗体(抗-HBs抗体)。结论rAAV-HBsAg在体外能表达,免疫动物能诱导体液免疫反应的产生。rAAV-HBsAg有希望成为乙型肝炎候选疫苗,也可以进一步用于探索慢性乙型肝炎的免疫治疗。 相似文献
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海洛因瘾康复期使用纳曲酮防止复吸100例 总被引:2,自引:0,他引:2
目的:观察盐酸纳曲酮防止海洛因依赖者戒毒后复吸疗效。方法:mo1~2每日口服纳曲酮片15~20mg,mo3~4服10~15mg,mo5~6服5~10mg,6mo为一个疗程。结果:3mo复吸率为42%,6mo复吸率为72%,显效率为45%,有效率为74%。结论:服药后可明显减轻海洛因依赖者对毒品渴求感和焦虑症状,降低复吸率。纳曲酮本身无依赖性,副作用轻微。 相似文献
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目的:探讨利用肝脏特异性microRNA-122(miR-122)调控外源基因在肝细胞的表达,减轻单纯疱疹病毒1型胸苷激酶和更昔洛韦(herpes simplex virus type 1-thymidine kinase/gancyclovir,TK/GCV)治疗系统的肝毒性。方法:通过在相应基因的3′非翻译区(3′UTR)插入miR-122靶序列,构建miR-122调控的pEGFP-122T、pLuc-122T和pTK-122T表达载体,分别转染miR-122阳性的Huh7肝癌细胞和miR-122阴性的HeLa宫颈癌细胞,观察细胞中报告基因的表达及TK/GCV的细胞毒杀伤作用。水动力法分别注射上述质粒至小鼠体内,冰冻切片和活体成像观察肝脏EGFP和Luc的表达,通过小鼠血清ALT、体质量变化、存活率和肝脏病理变化评价TK/GCV系统的肝毒性。结果:在Huh7细胞,miR-122靶序列的插入抑制了EGFP的表达和Luc的活性,减轻TK/GCV的毒性杀伤;而在HeLa细胞,miR-122靶序列的插入对报告基因表达和TK/GCV的杀伤无影响。体内实验结果显示,pEGFP-122T处理组的肝细胞不表达EGFP,而pEGFP处理组的肝细胞有30%高表达EGFP;与pLuc处理组相比,pLuc-122T处理组的Luc活性下调了33.70%。pTK处理组小鼠血清ALT显著升高、体质量进行性下降、肝脏出现明显病理损伤,进而引起小鼠死亡;而pTK-122T处理组小鼠血清ALT正常、无体质量下降、肝脏切片未见病理改变。结论:miR-122靶序列的插入可抑制外源基因在肝脏的表达,并可有效地降低TK/GCV系统的肝毒性。 相似文献
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目的 利用共表达的分泌型荧光素酶Gluc(gaussia princeps luciferase)和非分泌型荧光素酶Fluc(firefly luciferase)研究重组8型腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus type 8,rAAV8)介导的转基因在小鼠体内的表达特点.方法 制备携带双荧光素酶基因的重组8型腺相关病毒rAAV8-Gluc/Fluc,体外感染HEK293细胞并检测上清和胞内Gluc和Fluc活性;将不同剂量的rAAV8-Gluc/Fluc尾静脉注射或肌内注射至BALB/c小鼠,通过尾静脉采血检测Gluc活性,通过活体成像和裂解组织检测Fluc活性.结果 成功制备了rAAV8-Gluc/Fluc,可以有效感染HEK293细胞,同时分泌表达Gluc和胞内表达Fluc;尾静脉注射或肌内注射rAAV8-Gluc/Fluc至小鼠后,外周血Gluc活性均在注射后10 ~20 d达到高峰并稳定持续120 d以上,Gluc活性随注射剂量增加而增高;静脉注射rAAV8-Gluc/Fluc时Fluc主要在肝脏表达,在骨骼肌和心肌有少量表达,而肌内注射时Fluc既在肌内注射局部表达同时也在肝脏中表达.结论 本研究成功制备了携带双荧光素酶基因rAAV8-Gluc/Fluc,研究了其介导的转基因在小鼠体内的表达特点,为rAAV8的临床前应用打下基础. 相似文献
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目的 利用大容量人源性SARS单链抗体库筛选N蛋白的特异性单链抗体。方法利用RT-PCR的方法克隆了SARS病毒的N蛋白基因,克隆入原核表达载体pBV220,在大肠杆菌DH5a中进行表达并经离子交换色谱纯化后得到了纯度达95%以上的N蛋白,然后以此蛋白包被25cm^2组织培养瓶,对SARS单链抗体库进行先松弛,后严谨的筛选、富集,进行4轮筛选后对所筛的抗体进行ELISA鉴定。结果经过4轮的筛选、富集,得到了1株高亲和力的N蛋白单链抗体N18。结论在对SAILS疾病的早期检测或筛查、SARS病毒的生活周期及发病机理的研究中N18将起到重要的作用。 相似文献
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目的 构建稳定复制中国流行株C基因型HBV的小鼠模型.方法 将携带1.3倍C基因型HBV基因组(adr血清型)的重组腺相关病毒rAAV8-1.3HBV-C转导人肝癌细胞HuH7,采用ELISA法评估HBV抗原(HBsAg、HBeAg)在肝癌细胞中的表达.筛选高表达的重组病毒,经尾静脉注射入6~8周龄C57BL/6小鼠体内,建立HBV-C复制小鼠模型(实验组,n=8);同时建立文献已报道HBV-D复制小鼠模型(对照组,n=7,rAAV8-1.3HBV-D,ayw血清型).动态监测两组小鼠血清(眼底静脉丛采血)HBV DNA载量和HBsAg、HBeAg的抗原表达量;于第9周处死小鼠,HE染色观察肝组织病理改变,免疫组化染色分析HBsAg和HBcAg的表达.结果 重组病毒rAAV8-1.3HBV-C体外转导人肝癌细胞HuH7,72h后细胞上清中可检测到HBsAg和HBeAg的表达.小鼠注射重组病毒后第2、3、5、7、9周,血清HBV DNA存在稳定复制,血清HBeAg表达水平较稳定,但血清HBsAg表达存在波动.两组小鼠肝组织未见明显的炎性细胞浸润及组织结构异常,但可检测到HBsAg和HBcAg蛋白.结论 利用高嗜肝性重组8型腺相关病毒载体携带1.3倍C基因型HBV基因组体内转导C57BL/6小鼠,成功地建立了稳定复制并持续表达C基因型HBV的小鼠模型. 相似文献
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美沙酮与丁丙诺啡联合用于海洛因依赖者脱毒治疗临床评估性研究 总被引:3,自引:0,他引:3
本文采用美沙酮与丁丙诺啡联合用药方案治疗海洛因依赖患者60例,并与单药美沙酮组30例,单药丁丙诺啡组30例进行比较,结果显示联合用药组控制 断症状满意,两药过渡平衡,减药时症状反复较少,方法简便,10d左右可完成脱毒治疗.脱毒成功率为83.3%。 相似文献
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重组AAV2/hFⅨ病毒制备及其基因治疗血友病B的实验研究 总被引:3,自引:0,他引:3
目的 制备携带人凝血因子Ⅸ (hFⅨ )基因的重组AAV2病毒 (rAAV2 /hFⅨ ) ,并对用rAAV2 /hFⅨ肌肉注射治疗血友病B模型小鼠的疗效进行评价。方法 通过“一株载体细胞 /一株辅助病毒”的双因素包装策略制备出rAAV2 /hFⅨ ,体外转导BHK 2 1、C2C12细胞后 ,检测细胞培养上清中hFⅨ的表达量 ;肌肉直接注射血友病B模型小鼠后 ,检测其血浆中hFⅨ的抗原水平和凝血活性等指标。结果 转导 2 4h后在细胞上清中即可检测到hFⅨ ,连续检测 12 0h都有表达 ,BHK 2 1、C2C12细胞 2 4h最高表达量分别达到 (5 1.0± 6 .5 )ng/ 10 5细胞和 (6 8.0± 7.2 )ng/ 10 5细胞。rAAV2 /hFⅨ经肌肉直接注射后 ,高、中、低三个剂量组均能检测到小鼠体内高效表达hFⅨ ,在给药后第 3周达到高峰 ,小鼠血浆中hFⅨ的表达量与对照组比较差异有显著性 (P <0 .0 1) ,之后缓慢下降 ,到第 10周仍可检测到低水平hFⅨ表达 ;取第 3周小鼠血浆样品检测凝血功能 ,高、中、低剂量组FⅨ活性均得到明显改善 ,小鼠的割尾实验出血时间明显缩短 ,5min失血量也相应显著减少 ,其中高剂量组hFⅨ最高表达量达到 (387.0± 12 .5 )ng/ml血浆 ,FⅨ活性达到正常水平的 (30 .0± 5 .5 ) % ;给药后第 10周 ,除在注射点外 ,其它主要脏器均未检测到AAV载体DNA。结论 相似文献
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