mRNA水平探究人脂肪干细胞对SD大鼠放射性皮肤损伤的炎症修复作用

目的 从mRNA水平探究人脂肪干细胞（human adipose-derived stem cells,H-ADSCs）在SD大鼠放射性皮肤损伤中的作用及炎症机制。方法 选取15只SD大鼠,采用随机数字表法分成5组,每组3只。给予各组大鼠背部皮肤45Gy电子线照射,分别于照射后0周、1周、2周、3周、4周后处死并取组织标本,检测皮肤组织内炎症因子mRNA水平。选取35只SD大鼠,采用随机数字表法分成空白对照组（n=7）、PBS组（n=14）和ADSCs组（n=14）。空白对照组不做任何处理,PBS组和ADSCs组大鼠背部皮肤给予45Gy电子线照射,辐射后48h起,每72h完成1次注射,共5次,PBS组的大鼠注射1ml PBS,ADSCs组大鼠注射1ml含ADSCs的PBS,共注射5次。观察大鼠皮肤大体形态及病理组织学损伤,进行皮肤损伤评分,同时检测大鼠皮肤组织内炎症因子mRNA表达水平变化。结果 辐射后2d,两组大鼠的Douglas and Fowler评分比较,差异无统计学意义（P>0.05）;辐射后4～10d,ADSCs组大鼠的Douglas and Fowler评分均显著低于PBS组（P<0.05）;至辐射后12d,两组大鼠的Douglas and Fowler评分达到一致。辐射后2周,PBS组和ADSCs组大鼠均出现相同面积及相同程度的皮肤损伤;辐射后3周至处死前,ADSCs组大鼠皮肤损伤面积比值均显著低于PBS组（P<0.05）。辐射后3周时,PBS组和ADSC组大鼠皮肤内的肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）、白细胞介素（interleukin,IL）-6、IL-10、IL-1β,TNF-α等炎症因子的mRNA水平均显著高于其他时间点（P<0.05）,且显著高于空白对照组（P<0.05）。与PBS组相比,ADSC组TNF-α,IL-1β,IL-6水平均显著降低（P<0.05）,IL-10显著升高（P<0.05）。PBS组与ADSC组的NOS及Arg水平比较,差异均无统计学意义（P>0.05）。结论 H-ADSCs能有效促进大鼠放射性皮肤损伤创面修复,其机制可能是H-ADSCs促进抑炎因子表达、降低促炎因子表达,从而抑制炎症反应发挥生物学效应。     

免疫调节性寡聚脱氧核苷酸筛选方法的建立、优化和应用

目的:建立一套合理而便捷的实验体系,为开发新型免疫调节性寡聚脱氧核苷酸(ODN)提供筛选方法。方法:利用含有CpG基序的免疫刺激性寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)作为刺激物,将人外周血单个核细胞(PBMC)作为研究对象,分别以细胞的增殖程度和刺激上清的抗病毒活性作为检测指标,优化各项实验条件,综合评定寡聚脱氧核苷酸的免疫调节活性。结果:成功建立了由阳性免疫调节性ODNA151抑制CpG ODN诱导的人PBMC增殖及抗病毒活性的筛选方法。结论:免疫调节性ODN筛选方法的成功建立,为下一步研究开发新型免疫调节性ODN奠定了基础。     

建立一种用重组蛋白检测抗口蹄疫病毒抗体的间接ELISA方法

目的研究以重组蛋白作为包被抗原检测口蹄疫病毒（FMDV）感染后的动物血清中特异性抗体的可能性,为建立一种非病毒颗粒的ELISA检测试剂盒提供实验依据。方法利用自行构建表达的O型口蹄疫病毒VP1表位肽重组蛋白（VP1epi）作为包被抗原,采用间接ELISA方法确定抗原的最佳工作浓度和包被方法,优化各项实验条件,并以FMDV感染后的豚鼠血清作为标准阳性血清确定ELISA方法的特异性和灵敏度。结果FMDV感染后的阳性豚鼠血清可以很好地识别VP1epi重组蛋白,用此蛋白包被检测抗FMDV抗体的灵敏度可达1∶3200,并证明所检测的抗体是FMDV特异性的。结论VP1epi重组蛋白可以替代FMDV颗粒用于建立检测抗FMDV抗体的ELISA试剂盒。     

预成冠在磨牙缺损修复中的应用

磨牙、特别是第一磨牙由于萌出时间、解剖特点等原因,常常牙冠过早地大面积缺损用一般的门诊修复难于解决,或因缺损面积大,治疗后容易折断的患牙,均可用预成冠进行修复。我们自1994年以来对8～45岁的62例患者的67个牙齿进行预成冠修复,取得了良好的临床效果。     

抗O型口蹄疫病毒VP1单克隆抗体的制备与鉴定

目的：制备抗O型口蹄疫病毒（FMDV）衣壳蛋白VP1的单克隆抗体（mAb）并进行特性鉴定。方法：以自行构建表达的O型FMDV—VP1表位重组蛋白（VP1epi）为抗原免疫BALB／c小鼠，按常规方法进行细胞融合。采用有限稀释法和间接ELISA法克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株，用Western blot、间接ELISA和斑点免疫测定法对mAb的特异性进行鉴定。结果：成功地获得1株分泌抗VPlepi重组蛋白mAb的杂交瘤细胞株“C7”，其分泌的mAb为IgG1亚类，能特异性地识别VP1epi重组蛋白，其腹水效价可达1：12800。斑点免疫测定法显示，该mAb能很好地识别灭活的FMDV。结论：VP1epi重组蛋白可代替FMDV制备抗天然FMDV—VP1的mAb。抗O型FMDV—VP1 mAb的成功制备，为进一步研究开发新型FMDV的检测方法奠定了基础。     

新型免疫调节性寡聚脱氧核苷酸的序列设计和筛选分析

目的：探讨免疫调节性寡聚脱氧核苷酸（ODN）设计原则和筛选方法,为研究和开发新型免疫调节性ODN提供参考。方法：利用含有CpG基序的免疫刺激性寡聚脱氧核苷酸（CpG ODN）作为刺激物,将人外周血单个核细胞（hPBMC）作为研究对象,以³H-TdR掺入法检测CpG ODN诱导的细胞增殖水平,对自行设计的ODN的免疫调节活性进行筛选分析。结果：通过对两批免疫调节性ODN的设计和筛选,得到具有较强免疫抑制活性的ODN 667B,与CpG BW006组相比,其抑制率达到66.3%（P<0.01）,并具有浓度相关性。结论：总结出免疫调节性ODN的设计原则,同时证明筛选方法可以用于免疫调节性ODN的筛选,为进一步研究开发新型免疫调节性ODN奠定了基础。     

铜绿假单胞菌注射液对多种人恶性肿瘤细胞株的增殖抑制作用

  目的   研究铜绿假单胞菌注射液(PA-MSHA) 在体外对人恶性肿瘤细胞(肝癌BEL-7402、乳腺癌MDA-MB-231、胃癌MKN-45、肺癌A549和结肠癌SW620) 生长状态的影响, 并进行PA-MSHA药物敏感度的比较和分析。   方法  将PA-MSHA (1.8×109/mL) 进行梯度稀释, 在体外分别与5种肿瘤细胞共同培养72 h, 并在显微镜下观察细胞生长和形态变化。用MTT比色法检测细胞的增殖水平, 并计算IC₅₀值。   结果  镜下观察发现, PA-MSHA对5种肿瘤细胞的生长均有显著抑制。MTT法检测显示, PA-MSHA能够有效抑制肿瘤细胞的体外增殖, 并呈现出明显的药物剂量相关性。PA-MSHA对BEL-7402、MDA-MB-231、MKN-45、A549和SW620细胞的IC₅₀值, 分别为2.12×108/mL、1.95×108/mL、2.09×108/mL、1.59×108/mL和1.32×108/mL。   结论  铜绿假单胞菌注射液能够直接抑制人恶性肿瘤细胞的体外增殖, 并且对不同来源的肿瘤细胞具有广谱抑制作用。5种恶性肿瘤细胞对PA-MSHA的药物敏感性依次为: 结肠癌SW620 > 肺癌A549 > 乳腺癌MDA-MB-231 > 胃癌MKN-45 > 肝癌BEL-7402。      

眼轮匝肌组织瓣转移术治疗眼睑缺损的临床研究

目的 探讨对眼睑缺损患者给予眼轮匝肌复合组织瓣转移修复术治疗，分析其临床效果。方法 选取2017年6月至2022年1月医院治疗的眼睑缺损患者72例进行回顾性分析，根据治疗方式不同分为观察组（36）与对照组（36）。对照组给予任意皮瓣转移修复常规手术治疗，观察组给予眼轮匝肌复合组织瓣转移修复术治疗。对两组术后随访半年，对两组切口愈合情况、术后并发症情况及治疗满意度进行统计比较。结果 在切口愈合情况方面，观察组术后6个月甲级愈合34例，与对照组术后6个月甲级愈合17例相比显著增加，愈合情况较对照组更优（P<0.05）；在术后并发症方面，观察组术后发生率8.33%与对照组总发生率30.56%相比明显降低，比较差异有显著性（P<0.05）；在治疗满意度方面，观察组总满意度88.89%与对照组总满意度66.67%相比明显增加，比较差异有显著性（P<0.05）。结论 对眼睑缺损患者给予眼轮匝肌复合组织瓣转移修复术治疗能够取得良好效果，可对切口愈合进行明显改善，使并发症发生率显著降低，有助于患者对治疗满意度的提升，值得临床应用推广。     

低温微创冷冻减脂动物模型的构建

目的：探讨建立大鼠皮下脂肪微创冷冻减脂实验的动物模型。方法：将大鼠随机分为低温组（0 ℃组、-20 ℃组、-40 ℃组、-60 ℃组、-80 ℃组）以及室温对照（Control组）,利用不同低温干预造成大鼠皮下脂肪局部冷损伤,观察脂肪厚度及病理学改变。结果：超声示各低温组均有不同程度脂肪厚度减少,在无皮肤损伤情况下低温-60 ℃干预60 s时脂肪厚度减少最为明显（P ＜0.01）。病理学显示局部冷冻后随着温度的降低,炎症细胞浸润与脂肪细胞破坏愈加明显,在低温-60 ℃干预60 s 3 d后脂肪组织炎症细胞浸润达到峰值（P ＜0.01）。与Control组比,-60 ℃组脂肪组织内NF-κB-p65在第2 周时表达明显上升,TGF-β1在第4周时阳性表达明显上升（P ＜0.01）。-20 ℃组TUNEL染色细胞凋亡逐渐增多,-60 ℃组干预60 s3 d后细胞凋亡最明显（P ＜0.01）。结论：采用低温探针技术在低温-60 ℃干预60 s条件下,可建立稳定的SD大鼠皮下脂肪微创冷冻减脂模型。     

利用小鼠脾细胞上清抗病毒活性建立新型抑制性ODN的体外筛选方法

目的：通过检测小鼠脾细胞上清抗病毒活性,建立一种体外筛选小鼠敏感的新型抑制性寡聚脱氧核苷酸(ODN)的方法,为后续小鼠体内实验提供抑制性ODN的体外筛选方法。方法：将小鼠脾细胞分为对照组、CpG 2216刺激组,收集不同浓度(0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00及32.00 mg·L^-1)的CpG 2216刺激上清及CpG 2216作用小鼠脾细胞不同时间(3、6、12、24、48、72及96 h)的刺激上清,通过VSV病毒保护实验检测的A578评价各组上清的抗病毒活性,确定CpG 2216的最佳作用浓度、作用时间及刺激上清稀释度;再将小鼠脾细胞分为对照组、CpG 2216刺激组、CpG 2216+抑制性ODN(A151)组,同上确定A151的最佳作用浓度;将小鼠脾细胞分为对照组、CpG 2216刺激组、CpG 2216+抑制性ODN(MAT01~06)组,应用上述优化的实验条件如各ODN剂量、作用时间等处理细胞后,收集刺激上清,采用VSV病毒保护实验,观察各抑制性ODN的抑制作用,以初步判定此方法的可行性。结果：筛选方法确定为：浓度为5×10⁶·mL^-1的小鼠脾细胞铺于96孔圆底细胞培养板,加入CpG 2216至终浓度2 mg·L^-1和/或抑制性ODN至终浓度16 mg·L^-1,孵箱中培养24 h后收集上清,1∶4稀释上清后加入已贴壁的L929细胞板内,共孵育18 h后弃上清,加入VSV病毒液继续培养48 h。弃净上清后结晶紫染色、脱色并检测A578。此种筛选方法可以区别本室自行设计的抑制性ODN之间的抑制活性。结论：成功建立了抑制性ODN抑制小鼠脾细胞抗病毒活性的筛选方法,抑制性ODN的小鼠体外筛选方法的建立,为后续抑制性ODN在小鼠体内的生物学活性观察提供了体外筛选平台。