志贺菌喹诺酮类耐药株gyrA和parC基因突变研究

目的检测志贺菌对喹诺酮类药的耐药情况,指导临床合理用药;探讨志贺菌喹诺酮类耐药株gyrA和parC基因的突变,分析GyrA和ParC氨基酸改变与喹诺酮类耐药的关系。方法 2010~2012年从宿州市3家综合性医院收集志贺菌76株,进行分离培养和血清型鉴定;采用K-B纸片法进行药物敏感试验;采用PCR方法检测志贺菌喹诺酮耐药决定区（QRDR）相关gyrA和parC基因,并挑选部分PCR产物进行DNA测序分析。结果收集的76株志贺菌中福氏志贺菌74株（占97.4%）,宋内志贺菌2株（占2.6%）;药敏结果显示志贺菌耐药情况严重,其中对阿莫西林耐药率最高,达100%;对头孢噻肟耐药率最低,为6.5%。对gyrA基因的序列分析发现3个导致氨基酸改变的基因点突变：Ser83→Leu,Asp87→Gly及His211→Tyr;对parC基因序列分析发现2个导致氨基酸改变的基因点突变：parC Ser80→Ile和Asp197→Asn。结论宿州市志贺菌感染仍以福氏志贺菌为优势菌群,且耐药严重,临床治疗志贺菌感染可优先选择头孢噻肟。志贺菌属对喹诺酮类药物产生耐药性与gyrA和parC基因突变有关,GyrA His211→Tyr和ParC Asp197→Asn氨基酸变异与喹诺酮类耐药的关系需进一步研究。     

刚地弓形虫China 1基因型成囊株在小鼠体内的动态分布

目的观察流行我国的刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)主要基因型China 1成囊株在感染小鼠体内的动态分布和包囊形成。方法采自武汉的猫源性刚地弓形虫株(TgCtwh1,基因型为China 1,即ToxoDB#9)包囊50个(约含1×104个缓殖子)经口感染SPF级CD1雌性小鼠50只,于感染后第2、4、7、10、14、21、35、50和72天,分别大体观察小鼠健康状况并测定体重;颈椎脱臼法处死小鼠,脑组织压片观察弓形虫包囊形成时间,计算成囊率,测量包囊直径;荧光定量PCR和组织接种方法检测弓形虫在血液、心、肝、脑和淋巴结组织中的动态分布。结果实验小鼠感染后第7天体重减轻(3.650±0.252)g;第10天[(1.730±0.017)g]与第14天体重差值[(-0.390±0.554)g]比较,有统计学意义(P<0.05)。感染后第21天,在脑组织中查获包囊,成囊率为80%,直径为20～40μm;至感染后第35天,小鼠成囊率增为100%,包囊直径为50～60μm。感染后第2天,TgCtwh1虫体即出现在血液、心、肝和淋巴结组织中,拷贝数分别为3.510±0.152、4.100±0.198、4.220±0.209和4.960±0.052,感染后第4天见于脑组织(3.800±0.154);血液中的虫体在第7天达峰值(5.240±0.115),随后逐渐下降,至第35天消失;心和脑组织中的虫体分别于第14天和第10天达峰值后(5.640±0.214和5.790±0.060)维持相对稳定的水平;肝和淋巴组织中的虫体分别于第7天和第10天达峰值(5.310±0.038和6.200±0.152),此后虫体逐渐减少,至第50天转阴。结论流行中国的弓形虫China 1基因型成囊株在感染小鼠体内虫血症可持续至少21 d,感染后第21天首次在小鼠脑组织内检测到包囊。     

不同条件下CIM试验检测耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的评价

目的评估不同底物、不同孵育时间下碳青霉烯类抑制法(CIM)对肠杆菌科细菌碳青霉烯酶表型筛选能力的差异。方法分别用亚胺培南、美罗培南、厄他培南作为指示底物对120株耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(CRE)进行CIM试验,再以美罗培南为指示底物,分别孵育0.5、1、2、4h进行CIM试验,并采用PCR及测序技术检测菌株是否携带碳青霉烯酶相关基因。结果碳青霉烯酶耐药基因PCR检测结果显示,120株CRE中,阳性93株,阴性27株。以亚胺培南作为底物,阳性95株,阴性25株;以美罗培南作为底物,阳性87株,阴性33株;以厄他培南作为底物,阳性68株,阴性52株。与PCR结果相比,三者的灵敏度分别是98.9%(92/93),90.3%(84/93),69.9%(65/93),差异有统计学意义(χ~2=18.43,P<0.01);三者的特异度均为88.9%(24/27)。3种底物的一致率分别为96.7%,90.0%,74.2%,Kappa值分别是0.90,0.73,0.44。在4个不同孵育时间下,灵敏度分别为46.2%(43/93)、58.1%(54/93)、90.3%(84/93)和90.3%(84/93),孵育2h和0.5、1h结果相比差异有统计学意义(χ~2=27.31,P<0.05)。结论亚胺培南、美罗培南CIM试验灵敏度和一致率均高于厄他培南,可作为合适的底物,同时2h为最佳孵育时间。     

日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶在虫卵阶段的定位

目的探讨谷胱甘肽-S-转移酶(Sj26GST)在虫卵阶段的表达、定位和重组蛋白(rSj26GST)的免疫诊断价值。方法从感染日本血吸虫尾蚴6周的兔肝脏中分离虫卵,分别用RT-PCR和免疫印迹(Western blotting)法检测Sj26GST基因在虫卵阶段的转录和翻译;同时用兔肝做免疫组化观察Sj26GST在虫卵内的分布。利用纯化的rSj26GST和日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA),采用间接ELISA法检测急、慢性血吸虫病患者和正常人血清。结果RT-PCR从血吸虫虫卵中扩增670bp的基因片断,Western blotting证明在虫卵阶段Sj26GST的表达;同时免疫组化显示Sj26GST主要分布在虫卵内毛蚴两边的侧腺。rSj26GST检测急、慢性血吸虫病患者和正常人血清的阳性率分别为92%、80%和0;用SEA检测以上标本,阳性率分别为96%、84%和2%。结论Sj26GST是SEA的主要组分之一,能刺激机体产生高滴度的抗体;rSj26GST为抗原诊断日本血吸虫病显示出高度的敏感性和特异性,具有实用价值。     

结膜吸吮线虫实验室感染大绕眼果蝇

在安徽黄山地区捕捉有绕眼习性的果蝇,将结膜吸吮线虫初产蚴混于果汁中,实验室喂饲感染果蝇,常温饲养20 d后,检查果蝇的感染情况。结果显示,大绕眼果蝇（Amiota magna）和冈田绕眼果蝇（A. okadai）的阳性率分别为30%（30/100）和21.6%（55/255）,两者间的差异无统计学意义（χ²=0.058 4, P>0.05）。将采自大绕眼果蝇的结膜吸吮线虫感染期幼虫接种家兔,35 d后在兔结膜囊内检获结膜吸吮线虫成虫及其初产蚴,表明在实验室条件下,结膜吸吮线虫可感染大绕眼果蝇。     

结膜吸吮线虫病一例

淮北市人民医院于2010年1月接诊了一名眼内寄生结膜吸吮线虫患者,现报告如下. 患儿:女,14个月,淮北市百善镇人.因"发现眼内不明虫体1天"于2010年1月22日就诊.     

MCP-1真核表达载体的构建和鉴定

目的构建大鼠MCP-1真核表达载体pcDNA3.1（＋）-MCP-1。方法据Genebank中大鼠MCP-1cDNA序列设计并合成特异性引物,提取糖尿病模型大鼠肾脏总RNA,利用PCR技术扩增出MCP-1全编码区基因片段,并将扩增产物TA克隆至pMD-18T载体,然后分别双酶切pMD-18T-MCP-1回收目的片段再克隆到真核表达载体pcDNA3.1（＋）中。结果PCR扩增得到大鼠成熟MCP-1的cDNA片段大小为500 bp,重组子利用限制性内切酶进行酶切、PCR鉴定和DNA序列分析得到真核表达载体pCDA3.1（＋）-MCP-1。结论成功构建了大鼠MCP-1真核表达载体,为进一步研究MCP-1的DNA疫苗奠定基础提供了条件。     

抗利什曼原虫药物在利什曼病患者的单核细胞和体外培养的THP1细胞内引起γ-干扰素受体1的上调

人类利什曼病在许多国家有很高的发病率和死亡率。WHO(2000)年报告，全世界有1200万患者，每年新发皮肤利什曼病病例100万～150万，内脏利什曼病病例约50万。传统的治疗药物是用含锑的复合物，如葡萄糖酸锑钠(SAG)、葡甲胺、喷他     

轮状病毒SA11衣壳蛋白VP7的毕赤酵母重组表达及IgY的制备

目的 真核重组表达轮状病毒(rotavirus,RV)SA11株VP7衣壳蛋白并制备、纯化其卵黄抗体(IgY).方法 将SA11标准株在MAl04细胞中增殖,收集病毒液.从病毒液中提取RNA,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增获得SA11株衣壳蛋白VP7的长度为978 bp的编码基因,将PCR产物连接到pMD18-T载体上,进行测序.将重组体哑克隆到分泌表达载体pPICZαB中,再将重组体转化人大肠杆菌Top10中,用BstXI线性化酶切重组质粒后电转入毕赤酵母X-33中,进行测序.转染成功的菌落再用甲醇诱导表达,亲和层析法纯化重组蛋白抗原,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹(Western blotting)鉴定,用重组蛋白免疫罗曼母鸡,收集鸡蛋,Western blotting鉴定、纯化IsY.结果 细胞增殖液中提取的RNA银染可见11个条带,成功构建了含pPICZαB-SA11 VP7的毕赤酵母X-33,毕赤酵母X-33分泌的融合蛋白被收集、纯化.毕赤酵母X-33表达的SA11 VP7的衣壳蛋白经Western blotting验证与预测蛋白相对分子质量40 200相符.从鸡蛋中提取的鸡的IgY验证为抗VP7的抗体.纯度可达到95%,1个鸡蛋能产10.2 mg的IgY.结论 抗重组RV SA11衣壳蛋白VP7和IgY的成功制备为疫苗和诊断试剂的开发奠定了基础.