构建玻片蛋白质芯片的实验研究

目的:探讨玻片蛋白质芯片的构建方法及其中间操作条件的选择与优化。方法:利用生物芯片点样仪将超微量蛋白质点到经特殊处理的玻璃片表面,然后选用不同的化学试剂对玻片背景进行封闭;再用荧光素标记的蛋白质与点样蛋白杂交;最后用生物芯片分析仪扫描成像并进行分析,比较不同条件下芯片的显示效果。结果:蛋白质样品与片基稳定结合,并保持原活性状态;封闭试剂选用酪蛋白或明胶效果较佳;点样探针与其特异蛋白质抗体可稳定结合,结合效果与点样蛋白浓度在一定范围内呈正相关;在1.6 cm×1.6 cm的玻璃片面积上,构建了36×36=1269点的蛋白质芯片。结论:本实验条件下,蛋白质抗原或抗体可以稳定地固定于经过处理的玻璃片表面.制成免疫型蛋白芯片,并可通过随后的抗原抗体反应与荧光素标记的相应抗体或抗原结合,用生物芯片分析仪可对其荧光信号进行检测分析。     

SARS-CoV S蛋白表位的表达及鉴定

目的:制备SARS冠状病毒S蛋白串联表位重组蛋白,为SARS的防治提供新型抗原蛋白。方法:应用抗原表位分析软件分析S蛋白的表位。选取其中16个表位,设计并合成表位串联重组蛋白编码基因Z,构建其原核细胞表达重组体,在大肠杆菌BL21(DE3)表达该重组表位蛋白Z,应用Ni离子亲合层析法纯化重组蛋白Z做抗原,采用皮下注射法免疫新西兰白兔。斑点杂交法测定抗Z-血清中S蛋白的抗体,ELISA法检测Z蛋白的抗原性。结果:构建了S蛋白重组表位蛋白Z的原核表达体,在BL21菌中表达了Z蛋白,Z蛋白免疫新西兰白兔后获得了抗Z血清。斑点杂交分析显示,抗Z血清识别哺乳动物细胞中表达的S蛋白。ELISA检测结果显示,抗Z血清识别SARS冠状病毒抗原。结论:建立了制备SARS冠状病毒S蛋白重组表位蛋白的方法,为防治SARS提供了新型抗原蛋白Z。     

肺癌患者胸水中MOC-31 mRNA的表达及临床意义

目的探讨MOC-31mRNA在肺癌患者胸水中的表达及临床意义。方法应用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR），检测74例肺癌和40例肺良性疾病患者胸水中MOC-31mRNA的表达，并与常规细胞学诊断进行对比。结果肺癌组胸水中MOC-31mRNA的阳性表达率为91．9％（68／74），肺良性疾病组胸水中MOC-31mRNA的阳性表达率为10．0％（4／40），差异有统计学意义（Χ^2=74．83，P〈0．01）：肺癌组胸水中MOC-31mRNA的表达与病理分型无关（P〉0．05）；MOC-31mRNA的检测对恶性胸水诊断的敏感度和准确度均明显高于常规细胞学检查（P〈0．01），但两种诊断方法的特异度差异却无统计学意义（P〉0．05）。结论MOC-31mRNA可作为检测肺癌患者胸膜微转移的分子标志物，是判断肺癌患者胸水中是否存在脱落癌细胞和肺癌临床分期的辅助参考指标。     

肺癌患者外周血中Chemerin的测定及临床意义

背景与目的 Chemerin是近来发现的一种类似于趋化因子的趋化蛋白,能够通过与其受体ChemR23的结合发挥对树突状细胞和巨噬细胞的免疫趋化作用,研究表明Chemerin的活化能够增强APC的吞噬作用及抗原递呈作用.随着研究的深入,Chemerin在肿瘤的发生发展过程中的作用也引起人们的重视.本实验中我们通过研究Chemerin在肺癌患者外周血中的表达来进一步探索Chemerin与肺癌的关系.方法 实验选取肺癌患者与健康体检者作为研究对象,应用ELISA法检测两组实验对象外周血中Chemerin的浓度,采用t检验比较两组间统计学差异.应用t检验及单因素方差分析比较肺癌患者外周血中Chemerin的浓度与年龄、性别、病理类型、分化程度、淋巴结转移情况、UICC分期等临床病理指标的关系.结果 42例肺癌患者外周血中Chemerin的浓度与31例健康体检者外周血中Chemerin的浓度具有明显统计学差异,肺癌患者外周血中Chemerin的浓度(1 965.81 pg/mL±374.03 pg/mL)显著高于健康体检者(1 111.44 pg/mL±250.72 pg/mL)(P＜0.001).肺癌患者外周血Chemerin浓度与各临床病理指标间均无统计学差异.结论 Chemerin可能具有作为肺癌的诊断标记的潜力.     

SARS-CoV人工合成基因CAGZ的克隆和表达

严重急性呼吸道综合征（severe acute respiratory syndrome。SARS）是一种传播快、病死率高、严重威胁人类健康和生命的急性传染病。WHO宣布一种新的冠状病毒（coronavirus）是引起SARS的病原体，即SARS—CoV，属于单链正义RNA病毒，其中纤突蛋白（Spike，S）是致病过程中的主要毒力因子，S蛋白含有若干B细胞表位。能够诱导中和抗体产生，这些特征使它成为研究基因工程疫苗的最佳候选结构蛋白。本研究应用生物信息学技术，对S蛋白结构进行分析，人工合成编码S蛋白抗原表位的嵌合基因，并将其克隆、表达，为SARS重组疫苗的研制奠定基础。现将结果报告如下。     

应用寡核苷酸芯片进行HLA-DQA1位点基因分型

为了构建HLA-DQA1位点寡核苷酸分型芯片并籍此建立一种应用于HIA系统基因分型的集成化技术平台，在多态性集中的HLA-DQA1第二外显子区域，自行设计一套寡核苷酸分型探针；采用本实验室自建的方法，制成寡核苷酸芯片。提取的基因组DNA以组间特异性引物，单侧引物荧光标记，行不对称扩增。杂交后扫描检测分析杂交信号，确定HLA等位基因型；分型结果以标准DNA和PCR产物测序检测。结果表明：100例样本芯片分型全部成功，其中50例标准DNA与其模板相符，另50例临床样本中随机选取的10例与其测序结果相符，其中2例分型结果不完全；重复杂交实验中，位点重现率95％。结论：研制的HLA-DQA1等位基因分型芯片，其准确性和重现性理想，且操作简便、快捷，有广泛的应用前景。     

甲状腺多原发癌九例报告

本文总结浙江大学医学院附属第一医院1997年1月-2007年12月收治的9例甲状腺多原发癌的临床资料,并综合国内同期相关报告,探讨该病的临床病理特征及治疗方式,现报告如下.     

肺癌患者胸腔积液中CK19 mRNA的转录表达及临床意义

背景与目的 常规细胞学诊断肺癌患者胸腔积液中的癌细胞具有重要的应用价值,然而对胸膜微转移的诊断是有限的.本研究拟探讨CK19 mRNA在肺癌患者胸腔积液中表达的临床意义.方法 应用RT-PCR方法,分别检测86例肺癌患者和40例良性疾病患者胸腔积液中CK19 mRNA的表达,并与常规细胞学诊断进行对比.结果 肺癌组胸腔积液中CK19 mRNA阳性表达率为93.0%(80/86),肺良性疾病组胸腔积液中CK19 mRNA阳性表达率为20.0%(8/40),两组间CK19 mRNA阳性表达率有显著性差异(x2=65.69,P＜0.01).肺癌组胸腔积液中CK19 mRNA阳性表达率与病理类型无关(P＞0.05).检测肺癌患者胸腔积液中的CK19 mRNA,明显优于常规细胞学诊断的敏感性和准确性(P＜0.01).结论 CK19 mRNA可作为检测肺癌患者胸膜微转移的分子标志物,是诊断肺癌患者胸腔积液中脱落癌细胞及其临床分期的重要参考指标.     

缺氧缺血脑损伤大鼠脑组织Cofilin 1与ERK1/2蛋白表达与磷酸化的分析

目的探索新生大鼠缺氧缺血脑损伤模型脑组织Cofilin1与ERK1/2蛋白表达与磷酸化及其在脑组织中分布的规律。方法新生7日龄SD大鼠,手术结扎左侧颈总动脉并经低氧处理造成缺氧缺血脑损伤(HIBD)模型,以假手术组为对照,应用western Blot和免疫组化方法检测损伤后一定时间段(0h～48h)损伤侧脑组织Cofilin1与磷酸化cofilin1(p-Cofilin1)及Erk1/2和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)的表达变化,同时检测其在损伤大鼠脑组织和细胞中的表达和分布。结果 Western blot检测显示,HIBD新生SD大鼠脑组织中Cofilin1在HI后的表达与对照组相比也未见明显改变,但磷酸化Cofilin1在HI后1h～12h之间降低,24h后恢复正常;ERK1/2蛋白在不同时点的表达与对照组相比未见明显差异,但可见磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)在缺氧缺血处理(HI)后0h略低于正常,而在1-2h内迅速升高并高于正常对照和假手术,在2h后又逐渐降低。免疫组化结果显示Cofilin1与p-cofilin1在损伤大鼠脑中主要分布于海马和大脑皮质,尤其p-Cofilin表达分布以海马的颗粒细胞为主,并且在HI后7d-14d表达明显增强,在21d则明显降低。结论 Cofilin和ERK的磷酸化修饰与缺氧缺血脑损伤的发生和发展过程有较密切的关系,且cofilin1和p-cofilin1在大脑海马区的定位分布,提示其可能与大脑的学习记忆功能的损伤与修复有一定的关系。