人结直肠癌细胞Drosha基因敲除细胞模型的构建

目的 为研究核酸酶Drosha与结直肠癌的关系,利用腺相关病毒（AAV）介导的染色体同源重组技术,构建Drosha基因敲除的HCT116结直肠癌细胞模型.方法 设计引物通过PCR扩增Drosha基因的同源臂,构建Drosha的AAV病毒打靶载体,通过病毒的包装、感染、抗生素新霉素（G418）药物筛选、PCR以及Western blot鉴定获得基因敲除阳性细胞株,通过Cre病毒感染去除抗性基因,最终建立敲除Drosha基因的结直肠癌细胞模型.结果 经过两轮打靶,分别将DNA双链上的Drosha基因去除并经Western blot鉴定,获得Drosha-/-阳性的HCT116细胞株.结论 通过AAV病毒介导的染色体同源重组技术,成功构建Drosha基因敲除的HCT116细胞系.     

纳米羟基磷灰石对人骨肉瘤细胞U2OS增殖和凋亡的影响

目的:探索纳米羟基磷灰石（Nano-HAP）对人骨肉瘤细胞U2OS增殖和凋亡的影响。方法:不同浓度的Nano-HAP处理人骨肉瘤细胞U2OS后，通过FDA染色检测Nano-HAP对细胞黏附的影响；CCK8实验和克隆形成实验检测Nano-HAP对细胞生长增殖的影响；最后利用Annexinv-FITC凋亡检测试剂盒检测Nano-HAP对细胞凋亡的影响。结果:不同浓度的Nano-HAP对U2OS的黏附没有显著影响，但是对U2OS的克隆形成具有显著抑制作用，同时在50 μg/ml 和800 μg/ml时，可以显著抑制骨肉瘤细胞U2OS的增殖。结论:Nano-HAP对骨肉瘤细胞具有显著的抑制增殖促进凋亡作用，但效应与纳米粒子浓度并无直接的线性关系。     

人骨肉瘤OS-732、Saos-2和U2OS裸鼠成瘤模型的建立和比较

目的:比较人骨肉瘤细胞OS-732、Saos-2和U2OS在基质胶（Martrigel）辅助条件下的裸鼠皮下成瘤情况,为研究临床抗肿瘤药物的动物模型奠定基础。方法:利用CCK8实验比较OS-732、Saos-2和U2OS三种骨肉瘤细胞的增殖情况;利用划痕愈合实验比较OS-732、Saos-2和U2OS三种骨肉瘤细胞的迁移情况;利用裸鼠皮下成瘤实验比较OS-732、Saos-2和U2OS三种骨肉瘤细胞移植裸鼠皮下的成瘤情况。将30只裸鼠按照简单随机方法分为6组:OS-732细胞分为A1组（高细胞量）、A2组（低细胞量）,Saos-2细胞分为B1组（高细胞量）、B2组（低细胞量）,U2OS细胞分为C1组（高细胞量）、C2组（低细胞量）。将各组细胞与Matrigel混悬后,于裸鼠左侧前肢腋下进行皮下注射,观察比较各组成瘤时间、成瘤率和肿瘤大小,并对肿瘤及主要内脏器官进行组织形态分析。结果:A1组和A2组成瘤时间为7天左右,成瘤率均为100%。A1组肿瘤体积和重量显著大于A2组,肿瘤体积分别为［(2 167.96±844.85) vs (975.05±987.33)］mm3,差异有统计学意义（P<0.05）;肿瘤质量分别为［(1.33±0.40) vs (0.55±0.50)］g,差异有统计学意义（P<0.01）。B1组和B2组成瘤时间为14天左右,成瘤率分别为100%和20%。肿瘤体积分别为［(1 222.67±1 171.80) vs 510.86］mm3;肿瘤质量分别为［(0.75±0.40) vs 0.4］g。由于B2组只有一只小鼠成瘤,因此没有对B1组和B2两组进行统计学比较。C1组和C2组均未能成瘤。结论:Matrigel作为辅助试剂的情况下,裸鼠的成瘤时间和成瘤率与骨肉瘤细胞恶性程度密切相关,同一种骨肉瘤细胞株移植的细胞数量越多,裸鼠成瘤率越高。     

过表达TRIM69抑制细胞内源c-Jun蛋白的表达

目的探索TRIM69负调控AP1信号通路及抑制内源c-Jun蛋白表达的分子机制。方法在子宫颈癌细胞He La细胞或人胚肾细胞HEK293T细胞共转染荧光素酶报告基因质粒和空载体或TRIM69,共转空载体组作为对照,通过双荧光素酶报告基因实验检测了TRIM69对8条关键信号通路的影响;在HEK293T细胞过表达TRIM69全长及各个结构域的截短体,通过Western blot实验检测了TRIM69抑制细胞内源c-Jun蛋白表达的关键结构域;在HEK293T细胞过表达TRIM69,利用cycloheximide(CHX)、MG132或chloroquine分别处理细胞,通过蛋白稳定性实验探讨了TRIM69负调控内源c-Jun蛋白表达的分子机制。结果 TRIM69可以特异负调控AP1信号通路(P0.05),并且TRIM69对内源c-Jun蛋白表达的抑制作用依赖于其RBCC结构域(P0.05),进一步研究发现TRIM69通过蛋白酶体途径影响内源c-Jun蛋白的稳定性(P0.05)。结论 TRIM69负调控AP1信号通路并通过蛋白酶体途径影响内源c-Jun蛋白的降解。