mdx鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及向肌细胞的诱导分化

背景：自体干细胞移植治疗可以克服异体干细胞移植治疗的局限性,但目前对于进行性肌营养不良模型mdx鼠骨髓间充质干细胞生物学特性及肌分化潜能研究未见报道。 目的：拟建立体外分离培养mdx鼠骨髓间充质干细胞的方法,并观察其成肌分化能力。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2006-01/07在中山大学附属第一医院神经病学实验室完成。 材料：4~6周龄纯系雄性mdx鼠10只,购自美国Jackson实验室,饲养于中山大学北校区动物实验中心。碱性成纤维细胞生长因子和兔抗鼠MHC抗体为Chemicon公司产品。 方法：全骨髓法体外分离mdx鼠骨髓间充质干细胞,差速贴壁法纯化扩增,胰酶+EDTA消化传代。取传至第3代的细胞,按1×104/孔接种于24孔板,置于含两性霉素B、碱性成纤维细胞生长因子、胎牛血清的DMEM培养基中向肌细胞方向诱导分化,2周后更换为不含两性霉素B、但添加马血清的DMEM培养基继续培养2周。 主要观察指标：鼠骨髓间充质干细胞形态、表面标志、生长曲线及成肌诱导分化。 结果：原代培养24 h后,鼠骨髓间充质干细胞约80%贴壁生长,第3代细胞多呈梭形,形态比较均一。鼠骨髓间充质干细胞表达CD29和CD44等间质类细胞的表面分子,不表达CD11B和CD45等淋巴造血细胞的表面分子。接种后第一两天细胞处于潜伏期,第3天细胞增殖旺盛,进入对数生长期,至第4天细胞数增长一倍,第5天进入平台期。两性霉素B诱导后细胞有少量死亡,停用后更换马血清促进细胞成肌,7~10 d可见有肌管样细胞形成,免疫荧光染色可见肌管样细胞呈MHC阳性,DAPI复染后可见肌细胞内有多个细胞核。 结论：在两性霉素B与马血清依次诱导条件下,体外可成功分离培养基因缺陷mdx鼠骨髓间充质干细胞,并证明其具有成肌分化潜能。     

面肩肱型肌营养不良实时荧光定量PCR诊断方法的影响因素分析

目的分析探讨面肩肱型肌营养不良（FSHD）实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）诊断方法的影响因素。方法通过改变镁离子终浓度、PCR扩增中退火温度、退火时间或延伸时间、RNaseH酶用量和活性等,确定FQ-PCR诊断FSHD的最佳反应条件。结果退火温度55℃、时间20s、镁离子终浓度5．OmM、RNaseH酶用量IOOU、RNaseH酶在95℃下灭活8min为最佳反应条件,其中RNaseH的活性选择对FSHD诊断的特异性影响较大。结论通过降低RNaseH酶的活性可提高诊断的特异性,最终确立了FSHD的FQ-PCR基因诊断最佳反应条件。     

血液流变学在常见几种疾病检测中的临床意义

对242例8种疾病患者血液进行血液流变学指标测定，并与40名体检健康者血液作比较分析。结果显示，临床常见的高血压，糖尿病，脑梗塞，脑动脉硬化，冠心病，慢性支气管炎，肺炎及脑中风等八种疾病的血液流变性都存在异常变化。提示在临床上可通过血液流变学指标的检查来帮助预防，诊断和治疗这些疾病。     

Micro-dsytrophin基因修饰的骨髓间充质干细胞移植后mdx鼠膈肌病理改变

目的探讨自体骨髓间充质干细胞(mMSCs)携带外源micro-dystrophin基因移植治疗mdx鼠对膈肌的影响。方法采用脂质体介导micro-dystrophin基因转染mdx小鼠mMSCs(microdys-mMSCs),通过尾静脉注射移植治疗mdx鼠,对照组移植等量的PBS液。在移植后4周、8周、12周和16周测定受体鼠血清肌酸激酶(CK)值、对膈肌进行HE染色、计数核中心移位纤维(CNF)比率,并用免疫荧光及RT-PCR法检测micro-dystrophin的表达。结果移植后血清CK值持续下降,各时间点膈肌病理改变较对照组有所改善,CNF比率下降,差异有统计学意义。免疫荧光可以检测到部分肌细胞膜能表达micro-dystrophin蛋白,并随移植时间延长micro-dystrophin阳性肌纤维比率增加,RT-PCR检测micro-dystrophin的mRNA有相同的趋势。结论 microdys-mMSCs移植治疗mdx鼠可以在受体鼠膈肌检测到micro-dystrophin的表达,减轻肌肉损伤并且改善mdx鼠膈肌的病理改变。     

人骨髓间充质干细胞移植促进脑梗死大鼠神经细胞再生和神经功能恢复

背景：有研究表明,骨髓间充质干细胞或神经干细胞同种移植可改善脑梗死模型鼠神经功能。目的：观察人骨髓间充质干细胞在移植大鼠脑神经功能梗死局部的内存活、迁移情况及神经细胞再生。方法：将人骨髓间充质干细胞经静脉注入免疫抑制的大脑中动脉闭塞模型大鼠,每周观察、记录移植大鼠的行为和神经功能状况（NSS评分、转棒实验）;于移植后1~8周处死大鼠,采用免疫组织化学染色,免疫荧光染色和RT-PCR检测检测移植大鼠大脑人细胞核抗原、神经干细胞标志物（巢蛋白）及神经细胞标志物（神经元核心抗原、脑型微管蛋白、胶质纤维酸性蛋白）的表达。结果与结论：骨髓间充质干细胞移植后2周,脑梗死模型鼠NSS评分明显降低（P〈0.05）、转棒实验停留时间明显延长（P〈0.01）,神经功能得到改善（P〈0.05）。人骨髓间充质干细胞移植后1~8周,在移植大鼠病变侧室管膜下区、海马齿状回、梗死灶周围均可检测到人细胞核抗原阳性细胞。移植后一二周,在移植大鼠病变侧室管膜下区、海马齿状回（CA1,CA3区）、梗死灶周围可见部分巢蛋白阳性细胞和mRNA表达,存续至8周。移植后2周,在移植大鼠病变侧室管膜下区、海马齿状回、梗死灶周围可见部分神经元核心抗原、脑型微管蛋白阳性细胞和mRNA的表达。移植后4~8周,在海马、梗死灶周围可见少量胶质纤维酸性蛋白阳性细胞和少量mRNA的表达。结果证实,静脉移植人骨髓间充质干细胞能在脑梗死模型大鼠脑内存活、并迁移至病变部位,继而分化为神经细胞,促进新生神经细胞的形成,改善移植大鼠的神经功能。     

经micro-dystrophin基因修饰后的自体骨髓间充质干细胞移植治疗mdx鼠的实验研究

目的探讨携带micro-dystrophin基因的自体骨髓间充质干细胞(mMSCs)在移植鼠体内分化为有功能肌细胞的可能性。方法采用逆转录病毒介导micro-dystrophin基因转染mdx小鼠MSCs(mMSCs),通过尾静脉注射移植治疗mdx鼠,在移植后不同时间点并检测血清激酶(CK)值,对腓肠肌进行HE染色、计数核中心移位纤维(CNF)比例,并用免疫荧光法,、逆转录-聚合酶链反应、Westernblot检测测micro-dystrophin的表达。结果移植后各时间点血CK值下降,腓肠肌病理改变较对照组有所改善,CNF比例下降,差异有统计学意义,部分肌细胞膜能表达micro-dystrophin蛋白,并随移植时间延长micro-dys-trophin阳性肌纤维比例增加,分别达到1%(8周时)、7%(12周时)和15%(16周时)。RT-PCR和Westernblot也发现,随着移植时间的延长,micro-dystrophin表达增加。结论自体mMSCs可携带外源性micro-dystrophin基因在受体鼠体内分化为micro-dystrophin阳性肌细胞。     

多重PCR在多重耐药鲍曼不动杆菌耐药基因检测中的应用

目的 建立能够同时检测多重耐药鲍曼不动杆菌(Multidrug-Resistant Acinetobacter Baumannii , MDRAB)多个耐药基因的多重PCR反应体系,了解MDRAB耐药基因分布情况,为临床治疗及感染控制MDRAB提供分子生物学依据。 方法 针对MDRAB 4种耐药基因blaoxa-23、blaAde-B、blaint-1及blaISCR-1分别设计4对引物,设计反应条件在同一PCR反应体系中同时检测这4种耐药基因,并采用建立的多重PCR反应体系检测临床分离MDRAB耐药基因携带情况。结果 本研究成功建立了一个可以同时检测4种MDRAB耐药基因的多重PCR反应体系,临床分离68株MDRAB耐药基因检测显示,1株同时携带有4种耐药基因,5株携带有blaAde-B、blaint-1及blaISCR-1,62株携带有blaoxa-23和blaAde-B。结论 多重PCR可以快速、高效、低成本检测MDRAB携带的耐药基因,多重PCR检测显示blaoxa-23及blaAde-B 是MDRAB携带的主要耐药基因。     

西藏小型猪乳牙牙体的组织结构特性

目的探索西藏小型猪乳牙牙体及牙胚的组织病理结构特性,为牙齿相关疾病及牙再生研究奠定基础。方法通过X线拍 摄西藏小型猪乳牙牙牙合系统结构,扫描电镜观察其乳牙牙釉质及牙本质超微结构,采用Micro-CT对乳牙进行扫描,Mimics软 件对颌骨及牙齿进行三维重建,进一步应用Image J 软件计算灰度值及计算乳牙矿化密度值,通过HE染色了解西藏小型猪牙 胚及牙髓组织结构特点。结果西藏小型猪乳牙牙冠由牙釉质、牙本质及牙髓组织构成。乳牙牙釉质和牙本质超微结构与人类 乳牙较一致,牙釉质和牙本质矿化密度值分别为2.47±0.09 g/cm3和1.72±0.07 g/cm3,牙胚和牙髓组织病理结构与人类牙齿结构 也较一致,乳牙牙髓组织处于未分化状态。结论西藏小型猪的乳牙解剖、超微结构、组织病理结构均与人类相似,是研究人类 牙体组织疾病发病及牙再生机制理想的动物模型。     

转基因修饰后的自体骨髓间充质干细胞移植治疗mdx鼠后成肌调节因子的表达研究

目的探讨携带micro-dystrophin基因的自体骨髓间充质干细胞移植入mdx鼠后在移植鼠体内分化为肌细胞的可能机制。方法采用逆转录病毒介导micro-dystrophin基因转染mdx小鼠MSCs（mMSCs）,通过尾静脉注射移植治疗mdx鼠,在移植后免疫荧光检测micro-dystrophin的表达并在不同时间点检测MyoD的表达。结果移植后成功检测到micro-dystrophin,其表达随着移植时间的延长而增加;随移植时间延长MyoD阳性肌纤维比例增加,分别达到9%（4周时）、15%（8周时）、28%（12周时）。RT-PCR和Westernblot也发现,随着移植时间的延长,MyoD表达增加。结论自体mMSCs可携带外源性micro-dystrophin基因在受体鼠体内分化为micro-dystrophin阳性肌细胞,移植入的干细胞向肌细胞的分化是一个持久的、连续的过程,成肌调节因子在调节其分化过程中发挥了重大作用。     

时间分辨荧光免疫分析法和免疫放射分析法检测HBsAg的对比分析

HBsAg存在于HBV的外壳部分,是乙型肝炎的早期诊断指标之一。绝大多数HBV感染者外周血出现HBsAg。我们用时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)法和免疫放射分析(IRMA)法对400份临床血清标本以及定值血清进行了HBsAg对比检测,现报道如下。材料与方法1材料血清:受检标本为广州邮电医院检验科收集的各类患者血清,检测前的标本保存于-20℃。adr亚型浓度为0.2μg/L、1.0μg/L定值血清,购自中国药品生物制品检定所。稀释用小牛血清购自郑州佰安生物有限公司。试剂:TRFIA定量检测试剂盒为广州市丰华生物工程有限公司和中山生物有限公司联合研制…