海南岛不明发热病人血虫媒病毒分离鉴定及抗体检测

目的从海南岛不明发热病人血中分离和鉴定虫媒病毒,并在当地人群进行抗体检测,以了解南方地区虫媒病毒的感染情况。方法采用微量法细胞培养对205份发热原因不明患者血标本进行病毒分离,应用生物学性状检测、间接免疫荧光试验(IFA)和血凝抑制试验(HI)等技术对分离病毒进行鉴定。采用IFA检测从当地人群血清中分离出的病毒的抗体水平。结果从发热早期患者血标本中分离出2株病毒,鉴定为甲病毒,命名为HF 7和HC 6。这2株病毒与8种甲病毒免疫腹水中的SIN的免疫腹水呈现最高的血凝抑制滴度(分别为1∶160和1∶320),与SIN免疫腹水的交叉荧光效价最高(分别为1∶320和1∶640),但HF 7和HC 6病毒的免疫腹水与8种甲病毒的血凝抑制试验和交叉免疫荧光试验无反应,表明HF 7和HC 6病毒虽与SIN病毒的免疫腹水血抑效价及荧光效价高,但HF 7和HC 6的免疫腹水与SIN病毒无抑制效价和免疫荧光效价。当地人群对这两株病毒感染的抗体阳性率分别为3.3%(15/451)和8.4%(38/451)。结论HF7和HC6为甲病毒的一个新种。海南岛人群存在甲病毒感染。     

广东流行的三株登革1型病毒包膜蛋白基因的序列测定与分析

目的通过对广东省不同地区、不同流行期间分离的三株登革1型病毒(DVI)的结构蛋白E基因进行序列测定及分析．了解各流行株之间的遗传差异，追踪其可能的传染来源：方法应用RT-PCR技术扩增病毒的结构蛋白E基因，克隆到PMD18-T载体．转化JM109宿主菌，挑取阳性克隆进行鉴定及序列测定，应用计算机软件与国内外参考及流行株进行同源性分析．并绘制基因系统发生树：结果3株DVI病毒E基因序列长度均为l485bp，编码495个氨基酸，核苷酸序列同源性在91％～98％之间、推测的氨基酸序列同源性在94％～99％之间：GD23／95与A88核苷酸(氨基酸)同源性为95％(98％)，与其他株的同源性相对较低，2株属同一基因型；GD14／97和GD05／99与Cambodia共享序列非常接近．3株同属另一基因型。结论广东省1997、1999和1995年流行的登革热可能来自境外不同的疫源地。     

套式逆转录聚合酶链反应在黄热病毒快速检测中的应用

目的 建立灵敏、特异的套式逆转录聚合酶联反应(RT-PCR)快速检测黄热病毒方法。方法 参照黄热病毒标准株D17序列设计套式引物，并检索国际基因序列数据库初步验证其特异性，随后对镁离子、dNTP及引物浓度，PCR反应条件进行优化，建立稳定、特异的套式RT-PCR快速检测黄热病毒方法，并以同属于黄病毒科的登革病毒1～4型、流行性乙型脑炎病毒为对照，验证其特异性。结果 外引物扩增可获得404 bp左右的特异性扩增片断，阴性对照毒株未见设计大小的扩增片断，但可见非特异性片断；内引物扩增可获得349 bp左右片断，阴性对照无扩增条带。结论 套式RT-PCR可快速、灵敏、特异的检测黄热病毒。     

清开灵注射液对登革病毒Ⅱ型的抗病毒作用研究

目的 检测清开灵注射液在细胞模型上抗登革病毒Ⅱ型(DENV-Ⅱ型)作用.方法 本实验以白纹伊蚊C6/36细胞为宿主细胞,阿昔洛韦(ACV)为阳性对照药物,通过观察细胞病变效应(CPE)和改良MTT法检测细胞存活率来测定药物的细胞毒性、药物对DENV-Ⅱ的直接灭活作用、以及药物抗DENV-Ⅱ对细胞的吸附和对DENV-Ⅱ在细胞内复制的抑制作用.结果 该药在体外对DENV-Ⅱ无直接灭活作用,也不能阻止其对细胞的吸附,但对病毒在细胞内的增殖有明显的抑制作用,且呈一定的剂量效应依赖性.结论 该药在体外有一定的抗DENV-Ⅱ感染作用.     

RT-PCR法快速鉴定几种甲病毒感染

目的 简单、快速地鉴定几种临床症状相似的甲病毒及黄病毒感染,并将它们加以简单的区分。方法 从病毒培养细胞上清提取病毒总RNA,并用甲病毒特异性引物进行RT．PCR扩增,把扩增产物进行凝胶电泳。结果 通过凝胶电泳,观察到甲病毒科的辛德毕斯病毒扩增片段大小为1420bp,孔肯雅病毒为I630bp,罗斯河病毒病为1650bp,而属于黄病毒的西尼罗病毒和登革病毒无条带出现。结论 RT-PCR法可简单、快速地初步鉴定及区分这几株临床症状相似的病毒感染。     

连翘浓缩煎剂抗乙型脑炎病毒的体外实验研究

目的:在体外细胞模型上观察连翘浓缩煎剂对JEV感染的抵抗作用。方法:以白纹伊蚊C6/36细胞为宿主细胞,阿昔洛韦为阳性对照药物,通过观察细胞病变效应(CPE)和改良MTT法来测定受试药物的细胞毒性、药物对JEV的直接灭活作用、药物抗JEV对细胞的吸附作用以及药物对JEV在细胞内复制增殖的抑制作用,并计算出药物体外抗JEV感染的治疗指数。结果:该药物对JEV无直接灭活作用,最大无毒浓度为2.0mg/mL,半数中毒浓度TC50为23.2mg/mL,在16.0mg/mL以上浓度用药时有抗JEV吸附细胞的作用,也能抑制JEV在细胞内的复制增殖,半数有效浓度IC50为7.6mg/mL,治疗指数TI为3.1。结论:连翘浓缩煎剂在体外细胞模型中有较好的抗乙脑病毒感染作用,作用机理可能是干扰病毒对细胞的吸附及抑制病毒在细胞内的复制增殖。     

微孔杂交快速检测主要黄病毒方法的建立

目的建立特异、敏感、实用的登革病毒Ⅰ-Ⅳ型、流行性乙型脑炎病毒及黄热病毒检测及分型方法。方法在系统分析上述病毒基因组序列基础上,分别设计针对6种病毒的特异性包被探针,扩增、克隆、测序后包被聚乙烯微孔板。随后设计检测用PCR引物,并于引物5′端标记生物素,对待检样品进行扩增后用检测探针进行微孔杂交(PCR-ELISA)反应,并对包被DNA浓度、包被时间、杂交温度、杂交时间等反应条件进行优化。结果初步建立了微孔杂交快速检测上述病毒的方法,试验结果直观,阳性标本吸光度(A)值在0.5以上,阴性结果A值在0.1以下,S/N值在10.0以上。结论PCR-ELISA方法敏感、特异,为上述病毒的快速诊断提供了新的方法。     

多重逆转录-聚合酶链反应快速检测登革病毒及其临床应用

目的 建立登革1～4型病毒的多重逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)快速检测及分型方法。方法 参照登革1～4型病毒核酸序列设计多重RT-PCR引物，并检索国际基因序列数据库初步验证其特异性，随后对PCR反应条件进行优化，以同属于黄病毒科的黄热病毒、流行性乙型脑炎病毒为对照，验证其特异性。并对2003年30份临床疑似登革患者血清标本进行了检测，阳性片段克隆测序验证扩增片段特异性。结果 采用多重PCR引物对登革1～4型病毒进行扩增，分别获得295、237、118、347bp片段，与设计相符；而黄热病毒及流行性乙型脑炎病毒均无非特异性扩增条带，对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果，30份疑似患者血标本RT-PCR扩增阳性率为83．3％(25／30)，其核酸序列与登革1型病毒柬埔寨株以及中国1997、1999年流行株GD14／97、G1305／99同源性分别为97％、97％、98％。结论 实验证明，所建立的多重PCR方法能够快速地检测和鉴定登革1～4型病毒，为登革病毒的检测及分型提供了一种方便易行的方法。     

3株登革病毒1型广东分离株NS 1基因序列测定

登革热 (Ｄｅｎｇｕｅｆｅｖｅｒ ,ＤＦ)是一种急性虫媒传染病 ,严重者表现为严重的登革出血热或登革休克综合征 ,后者死亡率可达 5 %。广东省自 1978年以来 ,先后有 10多次登革热暴发流行。目前认为 ,我国登革热为传入性 ,但登革热的病原登革病毒 (ＤＶ)流行株的来源还不明确。我们通过测定我国广东省ＤＦ病人血清中分离的 3株ＤＶ - 1的ＮＳ 1基因序列 ,比较其核苷酸及其编码氨基酸的差异 ,探讨 1999、1997和 1995年在广东流行的登革热的可能来源。1　材料和方法　 (1)材料 :试剂为ｐＵＣｍＴ载体、3ＳＧｅｌＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉ…     

微孔杂交快速检测黄热病及乙型脑炎病毒方法的建立

聚合酶链反应(PCR)技术已广泛应用于疾病诊断，但由于临床标本复杂，常出现非特异性扩增条带或电泳拖尾现象，给结果的判定带来困难。为了探讨更加敏感、特异的流行性乙型脑炎病毒(JEV，乙脑)及黄热病病毒(YF)快速检测方法，我们分别设计了黄热及乙脑病毒的特异性包被探针及检测探针，建立了快速检测YF及乙脑病毒的微孔杂交(PCR-ELISA)方法。