新型隐球菌荚膜相关蛋白10基因mRNA测定的诊断价值

新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)是一种担子菌纲真菌,它广泛分布于自然界,可存在于土壤、鸽粪和桉树中,也可存在于人体体表.近年来,随着器官移植术的广泛开展、免疫抑制剂的广泛应用以及免疫缺陷综合征患者的不断增加,新型隐球菌引起的感染日益增多~([1-2]).     

建立FQ-PCR定量体系检测新型隐球菌CAP10 mRNA

目的建立荧光定量PCR（FQ-PCR）技术定量检测新型隐球菌（CN）的荚膜相关蛋白10（CAP10）基因mRNA,为新型隐球菌的诊断、预后及疗效判断提供依据。方法用逆转录PCR的方法从CN标准株（ATCC34874）中扩增得到CAP10,构建重组质粒标准品pGEMT—Easy-CAP10,以倍比稀释的标准品制备标准血线。设计引物和探针,建立FQ-PCR反应体系并对其重复性、特异性和线性范围进行评价。结果成功构建了重组质粒标准品pGEMT—Easy—CAP10,并用倍比稀释的标准品制备了标准曲线Y=-3．11X＋38．84。批内重复性试验CV值为0．31％,批间重复性试验CV值为2．73％。FQ-PCR体系能特异扩增新型隐球菌,特异性好,该体系的线性范围为10^1copies／μL～10^8copies／μL。结论成功建立CN的CAP10mRNA的定量检测方法;该方法重复性好,特异性强。     

建立FQ-POR定量体系检测新型隐球菌CAP10mRNA

目的建立荧光定量PCR（FQ-PCR）技术定量检测新型隐球菌（CN）的荚膜相关蛋白10（CAP10）基因mRNA,为新型隐球菌的诊断、预后及疗效判断提供依据。方法用逆转录PCR的方法从CN标准株（ATCC34874）中扩增得到CAP10,构建重组质粒标准品pGEMT—Easy-CAP10,以倍比稀释的标准品制备标准血线。设计引物和探针,建立FQ-PCR反应体系并对其重复性、特异性和线性范围进行评价。结果成功构建了重组质粒标准品pGEMT—Easy—CAP10,并用倍比稀释的标准品制备了标准曲线Y=-3．11X＋38．84。批内重复性试验CV值为0．31％,批间重复性试验CV值为2．73％。FQ-PCR体系能特异扩增新型隐球菌,特异性好,该体系的线性范围为10^1copies／μL～10^8copies／μL。结论成功建立CN的CAP10mRNA的定量检测方法;该方法重复性好,特异性强。     

糖尿病患者血清T3,T4,RIA

用放射免疫测定法对79例糖尿病患者空腹血清进行T_3、T_4 RIA检测,相应做血糖浓度测定,现将结果报告如下。     

应用RNAi技术探讨CAP10基因在新型隐球菌感染小鼠中对Th1-Th2型免疫的影响

目的 设计siRNA表达质粒干扰CAP10基因的合成,将siRNA干扰前与干扰后的新型隐球菌菌液经呼吸道感染小鼠分别建立动物模型,行组织病理学检查与细胞因子检测,探讨CAP10基因对Th1/Th2 免疫应答的影响。方法 建立小鼠吸入感染隐球菌模型,在感染后第7 d(急性期),PAS染色观察小鼠肺组织病理变化,并采用酶联免疫吸附试验定量检测小鼠血液中的Th1(IFN-γ、TNF-α)、Th2细胞因子(IL-10)水平。结果 急性期小鼠血液内IFN-γ、TNF-α及IL-10浓度测定分别为:对照组(uninfected组)(19.24±1.31)pg/mL,(36.94±2.04)pg/mL及(18.32±3.00)pg/mL,新型隐球菌未干扰组(WT组)(14.34±1.26)pg/mL,(25.37±1.37)pg/mL及(72.96±8.83)pg/mL,新型隐球菌干扰组(siRNA-CAP10组)(14.63±0.95)pg/mL,(26.22±1.55)pg/mL及(38.73±4.61)pg/mL。与对照组相比,WT组和siRNA-CAP10组Th1因子IFN-γ及TNF-α水平明显降低(P<0.01),Th2细胞因子IL-10水平明显增高。WT组与siRNA-CAP10组相比,IFN-γ及TNF-α水平未见明显增高而IL-10水平明显增高(P<0.01)。IFN-γ/IL-10及TNF-α/IL-10的比率分别为:对照组1.08±0.21,2.07±0.34,WT组0.20±0.03,0.35±0.05,siRNA-CAP10组0.38±0.04,0.69±0.09。WT组和siRNA-CAP10组IFN-γ/IL-10及TNF-α/IL-10的比率较对照组明显减少(P<0.01);WT组IFN-γ/IL-10及TNF-α/IL-10的比率亦明显低于siRNA-CAP10组(P<0.01)。结论 在新型隐球菌感染小鼠中,CAP10基因的表达与抗真菌的免疫反应有关,其下调有利于控制新型隐球菌播散,有利于Th1/Th2比率趋于平衡,在调节炎症反应方面有重要作用,有望成为新的分子治疗靶点。     

构建siRNA表达载体干扰新型隐球菌cap10基因表达及生物学意义

目的：构建针对cap10基因RNA干扰(RNAi)的siRNA表达载体,以抑制cap10基因表达并探讨其生物学意义。 方法：以cap10基因为靶基因,以psilencer4.1-CMV neo质粒为载体,设计构建重组体,根据GeneBank数据库提供的cap10基因核苷酸序列,按照干扰模板设计原则,选择设计1条可形成发夹结构的核苷酸序列,克隆连接到空载体psilencer4.1-CMV neo中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行测序分析。用LiAc化学法将重组质粒转染新生隐球菌细胞并用G418筛选。将各组新型隐球菌培养后分别定量测定cap10基因的表达情况。取培养后的新型隐球菌与巨噬细胞标准株J774A.1进行共孵育,在显微镜下观察,计算吞噬率和吞噬指数。 结果：所构建的针对cap10基因的ps4.1 neo-cap10,经DNA测序证实与设计完全一致;ps4.1 neo-cap10转染组细胞的cap10基因表达（175535±47004copies/μl）明显低于空质粒转染组（512698.89 ± 32318.02 copies/μl）和空白组（562932±65928copies/μl）（P＜0.05）。新型隐球菌与巨噬细胞株J774A.1共孵育后,干扰组平均吞噬指数和吞噬率（(0.21 ± 0.019, 19.06% ± 1.66%）,均高于对照实验组（0.079 ± 0.017, 6.57% ± 1.23%）和空白实验组（0.068 ± 0.014, 5.89% ± 1.07%）（P＜0.05）。 结论：成功构建cap10基因的siRNA表达载体,其可以明显抑制新型隐球菌cap10基因的表达,导致新型隐球菌逃避巨噬细胞吞噬的能力下降。     

VAD1 mRNA表达对新型隐球菌性脑膜炎患者脑脊液Th1/Th2免疫平衡的影响

VAD1 (virulence-associated DEAD-box RNA helicase)基因是新发现的新型隐球菌诸多毒力路径的重要调节因子.研究表明,VAD1调节着几个新的毒力所涉及的不同性状,如应激条件下生长、耐盐性和毒力表达[1].DEAD-box蛋白对于介导宿主-病原体之间的信号转导路径是至关重要的.例如,副黏病毒可结合在DEAD-box解旋酶-黑素分化相关基因5上,阻止其活化IFN-β启动子,从而抑制了抗病毒的IFN应答[2].提示VAD1这一DEAD-box解旋酶基因在新型隐球菌菌体致病与宿主防御中的重要作用.     

医学检验本科教学应用转化医学理念的思考

转化医学的典型含义是将基础研究的成果转化成为实际患者提供的真正服务手段,强调的是从实验室到病床旁的联接,其以患者或疾病为中心,基础紧密联系临床的转化医学理念与检验医学理念高度吻合。医学检验本科教育融入转化医学理念,有利于激发学生学习的主动性和积极性,推动医学检验教学理念和人才培养模式的革新。     

建立实时荧光定量PCR检测新型隐球菌CAPIO基因及其初步应用

目的建立FQ-PCR（real-time Fluorescent Quantitative PCR）系统定量检测新型隐球菌CAP10基因，为将其应用于新型隐球菌感染的诊断和疗效判断奠定基础。方法根据新型隐球菌5种血清型（A、B、C、D、AD）中同源序列设计引物和探针，PCR扩增CAP10基因片段，并将其克隆到pGEM-T Easy载体上，构建质粒标准品；建立FQ—PCR体系，优化反应条件，建立标准曲线，进行特异性、敏感性、重复性实验。结果FQ-PCR系统用于检测CAP10基因片段，敏感性为1拷贝数／出，重复性好，批内变异系数（CV）为1．36％，批间变异系数（CV）为1．86％，特异性好，对临床其他常见脑膜炎病原体不出现特异性扩增曲线。结论成功建立了新型隐球菌CAP10基因FQ-PCR检测方法，结果稳定、准确，有望为判断新型隐球菌性脑膜炎疗效、预后提供新的依据。