应用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除小窝蛋白1基因的神经细胞构建与功能鉴定

目的利用CRISPR/Cas9基因编辑系统建立小窝蛋白1(CAV-1)基因敲除的神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y),并验证其对流行性乙型脑炎病毒(JEV)的易感性。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,基于人源CAV-1基因的外显子区(EXON)序列设计小向导RNA(sgRNA),将sgRNA连接到载体PX459质粒上。将重组质粒转染至SHSY5Y细胞中,使用嘌呤霉素筛选稳定敲除CAV-1蛋白的SH-SY5Y细胞,并用免疫印迹法验证CAV-1蛋白的敲除效果。免疫荧光法比较CAV-1基因敲除的SH-SY5Y株与野生型细胞株对JEV感染性的差异。结果经酶切和测序鉴定,重组真核表达质粒构建正确,转染并筛选的单克隆细胞中没有CAV-1蛋白的表达,成功构建CAV-1基因敲除的SH-SY5Y细胞株。与野生型SH-SY5Y细胞株相比,CAV-1基因敲除的细胞株对JEV的感染性下降约90%(P0.001)。结论利用CRISPR/Cas9系统成功构建CAV-1基因敲除的SH-SY5Y细胞株,该细胞株可用于进一步研究CAV-1蛋白在JEV感染中的作用机制。     

生物恐怖事件医学救援队伍物资保障

生物恐怖事件医学救援物资装备保障,是有效组织实施防生救援的关键环节之一.本文结合实践经验,分析生物恐怖事件医学救援队伍物资装备保障的特点与难点,探讨救援队伍物资保障与个人装备保障的主要做法,并总结物资装备配备应注意的主要问题.     

医学微生物学实验教学改革探讨?

医学微生物学是一门重要的医学基础课程,实践性强,因此实验教学是理论与实践相结合的重要途径。为更好地提高医学微生物学实验教学,从实验内容设计、实验教学方法和实验操作指导等方面进行改革,使学生能够"心到、眼到、手到",激发学习的积极性和主动性。     

蚊体内病毒检测方法的研究进展

随着蚊媒传染病对人类社会的危害性逐渐增加,对蚊体内蚊媒病毒进行准确、快速检测的需求越来越迫切。从最初的分离接种法,发展到较新的分子生物学和快速检测试剂盒,检测技术的进步为实现蚊媒病毒的快速准确检测带来可能。本文就蚊体内病毒检测方法的研究进展进行综述。     

JEV和EV71感染SH-SY5Y细胞内吞途径的初步研究

目的初步探讨乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)和肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)感染人神经细胞的内吞途径机制。方法通过蛋白酶K实验检测JEV和EV71感染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的入侵速率。采用MTT法检测针对不同内吞途径关键分子的小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)以及化学抑制剂对SH-SY5Y细胞的细胞毒性。用JEV和EV71感染si RNA或化学抑制剂预处理的SH-SY5Y细胞,荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)检测不同处理对两种病毒m RNA和靶蛋白表达的影响。结果确定针对网格蛋白重链的si RNA(si CHC)最高工作浓度为50 nmol/L,针对小窝蛋白1的si RNA(si CAV1)的最高工作浓度为100 nmol/L。q RT-PCR结果显示,si CHC转染神经细胞能抑制EV71 m RNA的表达(t=17.153,P0.01),但不能抑制JEV m RNA的表达(P0.05);而si CAV1转染神经细胞能抑制JEV m RNA的表达(t=11.406,P0.01),但不能抑制EV71 m RNA的表达(P0.05)。针对网格蛋白途径的化学抑制剂氯丙嗪(Chlorpromazine)可抑制EV71 m RNA的表达(t=4.114,P0.05),且呈剂量依赖性,而氯丙嗪并不影响JEV m RNA的表达(P0.05);针对小窝途径的化学抑制剂非律平(Filipin)可抑制JEV m RNA的表达(t=4.064,P0.05),且呈剂量依赖性,而非律平并不影响EV71 m RNA的表达(P0.05),与si RNA结果相一致。结论初步推测JEV入侵人神经细胞是通过小窝蛋白1依赖性的内吞作用入胞,而EV71感染人神经细胞则是通过网格蛋白依赖型的内吞途径。     

血脑屏障动物模型的研究进展

血脑屏障(BBB)是中枢神经血管单元的重要结构,通过紧密连接及转运蛋白阻止神经毒性物质与病原体入侵,维护中枢神经系统内环境稳定.相较于体外模型,理想的动物模型可更好地模拟BBB生理机制,在血流动力学、屏障完整性、信号转导和物质交换等研究中起重要作用.在BBB动物模型评价方法的研究中,减少创伤、动态评估成为评价方法的重要...     

丙型肝炎病毒复制的研究进展

丙型肝炎病毒(HCV)感染是全球范围内导致慢性肝炎、肝硬化以及肝癌的重要原因.1989年,对一位输血后非甲非乙型肝炎患者的血清表达文库进行免疫筛选后,首次证实了HCV的存在[1].但HCV很难被直接观察到,也无法在体外进行有效的培养,这妨碍了病毒生命周期的阐明以及特异性抗病毒药物和预防性疫苗的发展.尽管存在种种障碍,在过去的18年中对HCV的研究还是取得了重大进展,主要通过异源表达系统、黑猩猩体内感染的功能性cDNA克隆、复制子(replicon)系统和假病毒(膜表面为功能性HCV包膜蛋白的逆转录病毒颗粒, HCVpp)以及HCVcc(细胞培养来源的HCV)等来实现的.本文就近年来HCV复制方面的研究进展作一综述.……