大鼠皮质神经元的体外培养和纯化

目的：探讨大鼠皮质神经元分离纯化的有效方法。方法：取胎鼠大脑皮质细胞，分别在不同的培养液中进行原代培养，利用相差显微镜对培养的细胞进行动态观察；并以免疫细胞化学技术对神经元进行染色。结果：在相差显微镜下可见加用N2添加剂和胎牛血清培养的神经元生长良好，胞体形态多样，突起数目多，长度长，与邻近神经元的胞体或突起形成接触，而胶质细胞则大量死亡，神经元纯化率达94％以上，未加用N2添加剂培养的神经元胶质细胞大量存在，神经元纯化率达50％左右。结论：N2添加剂和胎牛血清联合应用可使大鼠皮质神经元得到良好的生长和有效纯化。     

JNK通路可能介导MPTP诱导的黑质神经元凋亡

目的 探讨氧化应激激活的c-jun NH2-terminal kinase(JNK)细胞凋亡通路在1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)诱导帕金森病(PD)小鼠黑质神经元凋亡中的可能作用。方法 采用MPTP制备PD小鼠模型，应用生化技术检测黑质区域谷胱甘肽(GSH)浓度及超氧化物歧化酶(SOD)活力，尼氏体染色和酪氨酸羟化酶(TH)免疫组织化学染色观察黑质神经元的损害情况，原位缺口末端标记(TUNEL)染色和活化型Caspase 3免疫组织化学染色观察黑质神经元的凋亡情况，同时采用蛋白兔疫印迹法检测磷酸化JNK及磷酸化c-jun蛋白表达水平。结果 MPTP诱导的PD小鼠黑质区域GSH浓度明显降低，SOD活力明显升高，黑质致密带尼氏体阳性神经元和TH阳性神经元显著脱失，磷酸化JNK及磷酸化c-jun蛋白表达水平上升，同时活化型Caspase 3表达阳性细胞增多，黑质神经元TUNEL染色的阳性率增高。结论 MPTP可诱导小鼠黑质神经元凋亡，机制与增强氧化应激并激活JNK细胞凋亡通路有关。     

CDK4-pRB-E2F1通路是Aβ1-40诱导皮层神经元凋亡的可能途径

目的:探讨β淀粉样肽_1-40(beta-amyloidpeptide_1-40, Aβ_1-40)诱导大鼠皮层神经元凋亡的可能分子机制。方法:以40mg/L的Aβ_1-40诱导离体培养的大鼠皮层神经元凋亡, 流式细胞仪及免疫印迹方法检测细胞周期相关的周期依赖性激酶4(CDK4)、磷酸化的视网膜神经胶质瘤蛋白(pRB)水平;RT-PCR技术检测E2F1mRNA表达水平;荧光分光光度计检测半胱氨酸基天冬氨酸特异性蛋白酶3(caspase-3)活力;观察在Aβ_1-40诱导凋亡过程中是否伴随上述指标的变化。结果:①CDK4、磷酸化pRB水平在Aβ_1-40作用后2-4h显著升高;②Aβ_1-40孵育3h后皮层神经元E2F1基因表达上调;③Aβ_1-40作用12-24h后caspase-3活力明显升高。结论:CDK4-pRB-E2F1信号转导通路可能在Aβ_1-40诱导的大鼠皮层神经元凋亡中起主要作用。     

人参皂苷Rb1抑制β淀粉样蛋白25-35诱导的皮层神经元tau蛋白过度磷酸化

目的探讨人参皂苷Rb1对凝聚态β-AP_25-35诱导的胎鼠皮层神经元tau蛋白过度磷酸化的影响及其可能的作用机制。方法通过蛋白免疫印迹法和免疫细胞化学染色法检测神经元tau蛋白磷酸化水平、总tau蛋白水平和糖原合成酶3β(GSK-3β)的蛋白表达水平。结果凝聚态β-AP_25-35(20 μmol·L^-1)作用于皮层神经元12 h，tau蛋白磷酸化水平和总tau蛋白水平均增高，同时GSK-3β蛋白表达也增多。用人参皂苷Rb1或GSK-3β特异性抑制剂氯化锂预处理后，凝聚态β-AP_25-35诱导的tau蛋白的过度磷酸化受到明显抑制，同时GSK-3β的表达也降低。结论人参皂苷Rb1可通过抑制GSK-3β的表达来抑制凝聚态β-AP_25-35诱导的皮层神经元tau蛋白的过度磷酸化。     

人参皂苷Rg1抗衰老作用可能与改变p16、cyclin D、CDK4的表达有关

目的 :探讨人参皂苷Rg1对抗三丁基过氧化氢 (t BHP)诱导的WI 38细胞衰老作用及其可能细胞周期调控机制。方法 :将WI 38细胞随机分为 4组 ,用不同剂量Rg1预处理。从 30代开始 ,隔代用t BHP作用 ,每次 1h ,共 4次 ,诱导细胞衰老。从光镜、透射电镜观察细胞形态及超微结构 ;流式细胞术分析G1期细胞比例 ;以及SA β 半乳糖苷酶的细胞化学染色 ,确定Rg1的抗衰老作用。并采用免疫印迹技术对CDK4、cyclinD1和p16等表达情况进行检测。结果 :Rg1预处理组与单纯t BHP处理组相比 ,细胞形态体积小、胞体不如后者扁平 ,次级溶酶体减少 ,G1期细胞比例下降 ,SA β 半乳糖苷酶染色阳性细胞百分比下降 ,说明Rg1在t BHP诱导细胞衰老模型中有抗衰老作用。进一步发现用Rg1预处理后 ,p16、cyclinD1表达水平降低、CDK4表达水平增加。结论 :提示Rg1可能通过改变细胞周期调控因子的表达而发挥其抗t BHP诱导的WI 38细胞衰老作用。     

抗氧化作用可能是人参皂甙Rg1抗细胞凋亡的机制

目的 :探讨人参皂甙Rg1对MPP+诱导SHSY5Y细胞凋亡的保护作用及其可能的机制。方法 :用吖啶橙溴化乙锭染色观察SHSY5Y细胞凋亡率 ,流式细胞仪检测线粒体跨膜电位及细胞内活性氧 (ROS)水平 ,WesternBlot法检测bcl 2、bax蛋白表达水平。结果 :经 10 μmol·L- 1Rg1预处理后 ,MPP+诱导的SHSY5Y细胞凋亡受到明显的抑制 ,虽然线粒体跨膜电位无明显改变 ,但细胞内ROS下降 ,而bcl 2蛋白表达水平增加 ,bax蛋白表达水平减少。结论 :Rg1可抑制MPP+诱导的SHSY5Y细胞凋亡 ,其作用机制可能是通过清除ROS、调节bcl 2、bax蛋白表达水平起作用。     

反应性氧代谢物清除剂逆转ROM对NK细胞抗K562细胞系体外抑制作用

为了探讨新型反应性氧代谢物(reactiveoxygenmetabolites,ROM)清除剂在NK细胞抑制K562细胞时作为免疫佐剂的作用,采用IL-2及PHA活化单核(MO)细胞,使MO细胞的ROM产量增加,观察NK细胞活性和K562细胞抑制率(KIR)的相应变化,然后在不同比例的MO NK K562细胞培养体系中加入不同浓度的ROM清除剂(硫普罗宁),定期检测ROM产量及KIR(每种检测均做3个复孔),同时应用不同浓度的二氢氯组胺(DHT)作为阳性对照。结果表明:在K562细胞、NK细胞混合培养体系中,当E/T=10/1时,加入IL-2/PHA后ROM的产量从33.17±25.02U/ml增至223.59±59.41U/ml(P<0.05),KIR从65.56%升至85.89%(P<0.05);当按E/MO=10/2、10/5、10/10三种比例加入MO细胞后,ROM产量随着MO细胞数量的增加而增加(ROM产量分别为389.79±43.83U/ml,456.74±42.77U/ml,601.42±21.92U/ml),而KIR则相反(KIR分别为82.36%,81.36%,48.09%);而在K562 NK MO IL-2/PHA混合培养体系中加入硫普罗宁、DHT后,当E/MO=10/2时,ROM产量从389.79±43.83U/ml分别降至-1.20±60.70U/ml和50.21±22.4U/ml(P<0.05),KIR则从82.53%分别升至96.09%和94.64%(P<0.05)。随着硫普罗宁、DHT浓度的增加,ROM产量逐渐减少。ROM产量与KIR呈负相关(r=-0.518)。当E/MO为10/5或10/10时,各浓度硫普罗宁及高浓度的DHT可使ROM产量减少(P<0.05),但KIR提高不明显(P>0.05)。硫普罗宁在提高KIR的效应方面与DHT相似(P>0.05),而在清除ROM方面,硫普罗宁较DHT为优(P<0.05)。结论:①MO细胞是ROM产生的最主要来源,其产生的ROM可使NK细胞的抗瘤(抗K562)活性下降;②新型ROM清除剂(硫普罗宁)可有效清除ROM,在一定程度上逆转ROM对NK细胞抗K562细胞的抑制作用,且在逆转ROM方面优于DHT,在提高NK细胞对K562细胞的抑制率方面效应强度与DHT相似,但毒副作用较低,有望替代DHT作为免疫佐剂用于白血病的过继性免疫治疗中。     

一氧化氮可能参与多巴胺对PC12细胞凋亡的诱导作用

目的：探讨多巴胺（DA）诱导的PC12细胞凋亡是否与内源性一氧化氮（NO）生成有关。方法：酶还原法测定NO浓度，RT－PCR法检测诱导型一氧化氮合酶（iNOS)和caspase-3 mRNA表达水平，免疫细胞化学方法和蛋白印迹法分别检测活化型caspase-3蛋白和iNOS蛋白水平。结果：在多巴胺诱导PC12细胞凋亡过程中，iNOS mRNA和蛋白表达明显增加，内源性NO生成增多，caspawse-3mRNA和活化型caspase-3蛋白的表达也明显增加，结论：内源性NO可能参与多巴胺对PC12细胞凋亡的诱导作用。     

妊娠期脂多糖接触激活体内TLR4信号通路引起胚胎脑内炎症应激

目的: 观察孕鼠腹腔脂多糖 (LPS) 注射后母体外周血单个核细胞 (PBMNC) 上Toll样受体4 (TLR4) 信号通路激活情况和胚胎脑组织中炎症性细胞因子的水平。方法: 10.5 d孕鼠腹腔注射LPS 0、3、6、12、24、48 和72 h后,通过蛋白免印迹测定孕鼠PBMNC 上TLR4、分化抗原14 (CD14)、髓样分化蛋白2 (MD-2)、p65和p50蛋白水平,Luminex 100免疫荧光法测定孕鼠血清、羊水、脑组织及胚胎脑组织细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-10蛋白水平,实时RT-PCR测定孕鼠PBMNC和胚胎脑组织TNF-α、IL-1β和IL-10 mRNA水平。结果: LPS腹腔注射诱导激活孕鼠PBMNC上TLR4信号通路,TLR4、CD14和MD-2蛋白水平短暂增高,核因子κB (NF-κB) 激活片段p65 和p50蛋白水平增高,TNF-α、IL-1β和IL-10 mRNA水平增高(P<0.01);孕鼠外周血和羊水TNF-α、IL-1β和IL-10水平短暂增高(P<0.01),脑内IL-1β蛋白水平短暂升高(P<0.01);胚胎脑内TNF-α和IL-1β蛋白和mRNA水平显著增高(P<0.01)。结论: 妊娠期母体LPS接触可激活母体外周免疫细胞TLR4信号通路,引发胚胎脑内炎症应激状态,可能增加出生后相关疾病的发生风险。