以CpG为佐剂的犬细小病毒基因疫苗的初步研究

目的研制犬细小病毒(CPV)基因疫苗。方法以CPV VP2基因为基因免疫的目的基因,以pcDNA3和pcDNAK质粒为基因免疫的载体,以非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)为核心的免疫刺激序列为免疫佐剂,构建重组质粒并免疫BALB/c小鼠和毕格犬。结果经pcDNA3-VP2C1(含1个拷贝CpG基序)基因免疫的BALB/c小鼠能产生抗CPV血凝抑制抗体;对于经CPV灭活苗初次免疫的毕格犬,用pcDNAK-VP2C2(含2个拷贝CpG基序)质粒免疫产生的再次免疫应答优于pcDNA3-VP2C1。结论VP2基因、pcDNAK和犬源CpG可用于CPV基因疫苗的进一步研究。     

猪Toll样受体7基因人工miRNA表达质粒的构建与筛选

目的 构建猪Toll样受体7(TLR7)基因的人工miRNA (amiRNA)特异性表达载体,筛选有效amiRNA.方法 RT-PCR扩增猪TLR77基因的1984 ～2648 bp序列,构建融合表达载体pTLR7-EGFP.设计针对猪TLR7的5对amiRNA,构建重组干扰质粒pcDNA5-miRTLR7.将pcDNA5-miRTLR7和pTLR7-EGFP共转染NIH-3T3细胞,通过RT-PCR检测amiTLR7的表达,以荧光显微镜观察和流式细胞术分析干扰效率.结果 5个amiTLR7都成功表达,且均能沉默NIH-3T3细胞中TLR7基因的表达,抑制效率为36.99％到97.28％,其中amiTLR7-3效果最佳.结论 成功构建了针对猪TLR基因的amiRNA表达质粒,筛选出了沉默猪TLR7基因的最佳干扰序列.     

MPTP诱导树鼩帕金森病模型的脑电图描记与分析

目的 研究树鼩帕金森病(PD)模型的皮层脑电图和脑电功率谱、地形图特征.方法 选取普通级成年滇缅树鼩10只,随机分为模型组(n=5)和对照组(n=5).采用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)2 mg/kg肌肉注射建立树鼩PD模型,对照组注射等体积0.9％ 氯化钠溶液,连续15 d.停药1月后,采用EEG技术对树鼩PD模型进行皮层脑电图描记与功率谱、地形图分析.结果 成功建立树鼩PD模型.正常对照组树鼩大脑半球额部、顶部、枕部等各部位脑电波的频率、波幅、波形、相位无明显差异和特异性.脑电波各部位α波占主导,波幅差<30％;背景为散在δ、θ波;脑电功率谱直方图,两半球各频带功率值分布对称;地形图双侧六频带为低功率频谱,其功率值<100μv2/Hz.树鼩PD模型组记录到棘波、尖波等异常波形呈节律性发放,主要表现为α波左右不对称,异常波形主要表现在额部和顶部,部分出现高振幅慢波δ、θ;脑电功率谱主要表现为α波相位不同步,各频带功率谱直方图分布不对称;树鼩PD模型组地形图δ频段功率平均值>1000μv2/Hz,为低频高功率.δ、θ、α1、α2频带功率值与对照组相比显著性增高.结论 树鼩PD模型脑电波形图、脑电频谱直方图及脑电地形图较正常对照组具有显著的特异性,可为PD模型神经电生理研究提供参考.     

小鼠Calbindin-D28k基因体外表达及其抗凋亡作用的研究

目的:研究钙结合蛋白D28k(calbindin-D28k,CaBP)体外表达及其对神经元细胞抗凋亡作用。方法:RT-PCR从小鼠脑组织中扩增出小鼠CaBP的cDNA片段;重组构建pTH-CB质(pcDNA3-TH-CB),脂质体包裹pTH-CB质粒转染MN-9D细胞(多巴胺能杂交瘤神经元细胞);RT-PCR、免疫沉淀法检测CaBP的cDNA在细胞内表达情况;Hoechst染色、Caspase-3活性检测、AnnexinV/PI法对CaBP过表达的抗凋亡作用进行检测。结果:小鼠脑组织RT-PCR扩增出785bp条带,测序结果与Genebank中报道完全一致。脂质体包裹重组构建pTH-CB质粒转染MN-9D细胞后,转染pTH-CB质粒的MN-9D细胞中,CaBP的mRNA表达量和CaBP水平显著高于转染pc-DAN3组和正常MN-9D细胞组(P0.05),3种细胞凋亡检测方法结果显示,CaBP过表达的细胞抗凋亡能力显著提高。结论:体外克隆CaBP的cDNA能在细胞内表达,过表达的CaBP通过抑制细胞的caspase-3活性,起抗凋亡作用。     

大鼠腰椎腹侧神经根牵拉模型的建立

目的 为了研究肌萎缩侧索硬化症致病机理和药物研发,建立第4 腰椎腹侧神经根牵拉大鼠模型,并用脑源性神经营养因子作为阳性药物进行模型的有效性验证?方法 首先对5 只SD 雄性大鼠进行手术,一周后用抗胆碱乙酰转移酶抗体进行免疫组织化学染色观察脊髓前角运动神经元数量的变化;预实验证明手术模型成功后,将40 只7 周龄SD 雄性大鼠随机分为四组,两组模型对照组及两个脑源性神经营养因子治疗组(手术后立刻预防性给药组和手术后一周治疗性给药组)?使用抗胆碱乙酰转移酶免疫组织化学染色观察运动神经元数量的变化?结果 大鼠手术后恢复良好,临床观察无异常?染色结果证明手术牵拉后,造成明显的脊髓前角运动神经元变性死亡?与对照组相比,用脑源性神经营养因子治疗的神经根牵拉动物,不管是预防性给药还是手术1 周后再进行治疗性给药都达到了良好的治疗效果,胆碱乙酰转移酶染色阳性神经元细胞数量显著增加( P <0.0001),结果分别为17.85%比93.06%;26.6%比87.27%?结论< /b> 成功的建立大鼠第4 腰椎腹侧神经根牵拉模型,为肌萎缩侧索硬化症的研究提供了一种有价值的动物模型?     

绵羊CTLA-4胞外区对细粒棘球蚴EG95抗原的免疫佐剂作用

目的探索绵羊细胞毒性T细胞相关抗原-4(cytotoxic Tlymphocyte-associated antigen4,CTLA-4)胞外区靶向提呈羊细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)EG95抗原的可行性。方法用RT-PCR扩增CTLA-4胞外区编码序列,插入原核表达载体pET-30a获得融合表达载体pET-IgV;根据蛋白质二级结构分析结果 ,用PCR扩增EG95亲水区编码序列,将串联的3拷贝EG95编码序列分别插入表达载体pGEX-6P-1和pET-IgV,诱导重组大肠杆菌表达并纯化重组蛋白;用相同剂量的GST-3EG95、IgV-3EG95包涵体或可溶性蛋白免疫小鼠,比较EG95抗体的应答水平。结果用RT-PCR扩增得绵羊CTLA-4胞外编码区,IPTG诱导的重组大肠杆菌表达预期的约63kDa GST-3EG95和60kDa IgV-3EG95融合蛋白,两者均能被EG95抗血清识别;经两次免疫后,IgV-3EG95免疫组的EG95抗体水平显著高于GST-3EG95免疫组,可溶性蛋白的免疫效果优于包涵体。结论绵羊CTLA-4胞外区可作为分子佐剂促进细粒棘球蚴EG95抗原的抗体应答水平。     

人内皮抑素基因治疗卵巢癌裸鼠移植瘤的研究

目的探索人内皮抑素基因治疗人肿瘤的可行性：方法将人卵巢癌(SKOV3)瘤组织或其细胞移植于裸鼠皮下，建立成裸鼠移植瘤模型；用高保真PCR从含有人内皮抑素基因的重组质粒中扩增出与人生长激素信号肽序列融合的人内皮抑素编码区，将此基因克隆入pGEM-T载体中，经序列测定证明其序列的正确性；将此基因克隆入真核表达载体pcDNA3。经免疫荧光试验证明能在CPS-1细胞中表达。结果用重组质粒注射已形成移植瘤的裸鼠，能显著抑制移植瘤的生长；将基因注射与肿瘤移植同时进行，基因注射不仅能部分抑制移植瘤的形成，而且能抑制移植瘤的生长。结论本研究构建的分泌型表达人内皮抑素的重组质粒可以用于肿瘤的基因治疗研究。     

牛气管抗菌肽cDNA的克隆与表达

目的：开发一种有效抑制动物细菌感染的重组抗菌肽。方法：根据已发表的牛气管抗菌肽（bTAP）mRNA序列设计引物，用RT—PCR从奶牛气管上皮细胞总RNA中扩增出214bp的bTAPcDNA，将其克隆入pUCm—T载体进行序列测定，将此cDNA分别克隆入真核表达载体pcDNA3和原核表达载体pGEX-6p-1进行表达研究。结果：测序结果与已发表的bTAP序列有3个碱基差异，其中2个导致氨基酸替换；经微球菌溶解试验证明，注射在小鼠皮下的重组质粒pcDNA—tap能表达有活性的bTAP；抗体测定结果显示重组质粒pcDNA—tap经5次免疫后家兔产生的抗bTAP抗体效价达1：800；经IPTG诱导后，含重组质粒pGEX—tap大肠杆菌能表达预计大小的GST—bTAP融合蛋白，且能被兔抗bTAP识别。结论：本研究克隆的bTAPcDNA可用于表达研究及相关基因工程产品的开发。     

转人溶菌酶基因小鼠乳腺生物反应器的建立

目的 研究人溶菌酶（human lysozyme，hLYZ）动物乳腺生物反应器制备的可行性。方法 将hLYZ基因与动物乳腺特异表达载体p205C3连接，所得重组载体p205C3-hLYZ用显微注射法建立转基因小鼠。结果 共出生了136只F0代小鼠，PER和Southern杂交检测基因整合阳性率分别为5．15％（2♀5♂）和2．94％（1♀3♂）。Western印迹检测结果表明，分泌在小鼠乳汁中的表达产物与正常hLYZ具有相同的分子量。目前转基因小鼠已经繁殖到B代，每一代基因整合阳性母鼠的乳腺均表达hLYZ，乳汁中的表达量最高达750mg/L。斑点杂交试验证明，表达有较强的组织特异性，除在乳腺表达外，仅在脾脏和小肠有一定的异位表达。结论 成功建立了hLYZ小鼠乳腺生物反应器。     

人溶菌酶基因免疫抗体的制备及其初步应用

目的制备人溶菌酶(hLYZ)基因免疫抗体。方法用多聚乙酰亚胺包裹重组质粒pcDNA3LYZ,经肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠,以间接ELISA检测免疫血清中hLYZ抗体的效价,所得抗体用Western-blotting法检测转基因小鼠乳汁中重组hLYZ的表达情况。结果2次免疫后,小鼠体内产生了hLYZ特异性抗体,效价达1∶800,用此抗体为第一抗体在转基因小鼠乳汁中检测到分子量与正常hLYZ相同的重组hLYZ。结论用基因免疫方法在小鼠体内制备了可用于检测的hLYZ抗体。