干细胞脑内移植有效标记研究:绿色荧光蛋白质粒标记的应用价值

目的:观察绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)质粒转化小鼠胚胎干细胞(embryonicstemcell,ESC)的效果,以及将转化的胚胎干细胞移植入正常大鼠纹状体后,GFP质粒作为细胞存活情况示踪剂的效果。方法:首先利用感受态大肠杆菌提取大量高纯度GFP质粒DNA,然后将GFP质粒与脂质体孵育形成的转化复合物和小鼠胚胎干细胞共同孵育,使GFP质粒转入胚胎干细胞;筛选表达GFP的胚胎干细胞。将筛选后表达GFP的ESC移植入活体大鼠纹状体内,移植21d后,观察表达绿色荧光蛋白的移植细胞的存活情况。结果:GFP质粒转化以后的ES细胞团和单细胞都表达亮绿色的GFP,细胞打散计数证实大约60%的细胞携带GFP,移植21d后,大鼠脑内可见大量表达GFP的移植细胞。结论:脂质体可以将GFP质粒转入鼠的胚胎干细胞,携带有GFP的ES移植后21d,GFP可以作为示踪剂观察移植细胞的存活状况。脂质体辅助的GFP质粒转化胚胎干细胞是移植示踪的较好方法。     

神经干细胞的自发永生化

目的 观察培养达24个月的神经干细胞(NSC)是否会发生永生化和恶变.方法 培养流产胎儿皮层来源的NSC.对培养超过24个月的NSC,分析其核型,检测其自我更新、增殖、衰老以及移植后的致瘤性等.检测其Bmi-1-p16INK4a/p14ARF基因通路的改变.结果 体外培养超过24个月的NSC自我更新旺盛,克隆形成率(14.89±4.75)%,显著高于正常培养8周NSC的(8.04±2.07)%;生长速度快,表现为传代1周后的新生神经球的直径为(85.98±30.24)μm,显著高于体外培养8周NSC的(15.97±9.97)μm.此外,培养超过24个月的NSC衰老细胞为(5.96±2.81)%,远低于正常培养8周NSC的(78.14±8.99)%;而且染色体数目异常,这些结果可以确定其发生了永生化.裸鼠移植未发现致瘤性,所以该细胞未发生恶变.此2株细胞中Bmi-1、p16INK4a、p14ARF基因均缺失.结论 体外长期培养的人类皮层神经干细胞能够自发永生化,表现为不进入衰老状态并不断增殖.其增殖不依赖于Bmi-1基因,而其不衰老状态可能和p16INK4a、p14ARF基因缺失有关.     

汉族人群雌激素受体β基因多态性与子宫肌瘤的关系

目的研究在中国人汉族人群中,子宫肌瘤的发生与雌激素受体β(estrogen receptor,ERβ)基因多态性之间的关系。方法自2007年1月至2008年6月,采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)来扩增ERβ基因序列,用限制性内切酶对193名平均年龄为(39.64±7.14)岁的健康女性和92名平均年龄为(43.96±6.59)岁的子宫肌瘤患者的ERβ基因扩增产物酶切,测定其基因多态性。结果ERβ的基因多态性AluI在子宫肌瘤组与对照组之间的分布分别为78.3%、19.6%、2.2%以及69.4%、29%、1.6%(P=0.229);RsaI在子宫肌瘤组与对照组之间的分布分别为65.2%、25%、9.8%以及67.4%、28.5%、4.1%(P=0.162),2种基因多态性的分布在2组之间差异均无统计学意义。结论在汉族人群中,ERβ基因的RsaI和AluI多态性分布与子宫肌瘤的发生无相关性。     

胎儿骨髓MSCs中Bmi-1和p16基因表达与其复制老化的关系

目的：探讨胎儿骨髓间充质干细胞（MSCs）中Bmi-1和p16基因表达随传代次数增加的变化情况,阐明其与MSCs复制老化之间的关系。方法：取孕16、17和25周流产胎儿的股骨,利用贴壁培养法分离、培养、扩增骨髓MSCs。采用流式细胞术检测第5代MSCs中CD13、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD133和HLA-DR的表达;连续传代30代,诱导培养MSCs老化;用BrdU掺入率检测第5（P5）、15（P15）和30代（P30）骨髓MSCs的增殖能力;采用Real-time PCR法检测上述细胞中Bmi-1和p16基因mRNA的表达量。结果：从孕16、17和25周的流产胎儿股骨骨髓中均能分离、培养、扩增出MSCs,均表达CD13、CD44、CD73、CD90和CD105,不表达CD34、CD45、CD133和HLA-DR; 随着MSCs的不断传代,细胞生长速度逐渐减慢,细胞变成扁平状,折光性下降。P5与P15 MSCs的 BrdU掺入率比较差异无统计学意义（P>0.05）,P30 与P5和P15 MSCs的 BrdU掺入率比较均明显降低（P<0.05）。P5 MSCs中Bmi-1 mRNA表达水平高于P15和P30 MSCs（P<0.05）,P15 MSCs中Bmi-1 mRNA表达水平高于P30 MSCs（P<0.05）。P5与P15 MSCs中p16 mRNA表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）,但P30 MSCs中p16 mRNA表达水平明显低于P5和P15 MSCs（P<0.05）。结论：胎儿股骨骨髓能培养出MSCs,其复制老化与Bmi-1的表达有关联,但其信号通路可能不通过p16INK4a-Rb介导。     

基因检测在Ⅳ型埃勒斯-当洛综合征诊断中的意义

目的 埃勒斯-当洛综合征(Ⅳ型)是临床罕见病例,诊断困难,基因检测技术可明确该病诊断.方法 设计Col3A1基因引物,提取患者外周血标本DNA,PCR扩增后行测序分析碱基突变点,确认氨基酸变化位置,结合临床特征进行疾病诊断.结果 患者Col3A1基因外显子30的第2209个碱基及内含子15的第327碱基出现套峰.在2209位碱基出现G-A的突变,造成第698个氨基酸变化,由丙氨酸(Ala)改变为苏氨酸(Thr),即:P.A698T(c.2209G＞A),突变来源于先证者家系.结论 基因检测可以明确埃勒斯-当洛综合征诊断,对临床有指导意义.

Abstract：

Objective To ascertain the diagnosis of such a rare disease as Ehlers-Danlos syndrome type Ⅳ by the technique of DNA(deoxyribonucleic acid)analysis.Methods The primer sequences of Col3A1 gene were designed. Genomic DNA was isolated from the peripheral blood samples. The amplification of polymerase chain reaction(PCR)was performed and direct sequencing used to screen the mutations.A definite diagnosis was made in conjunctions with clinical features.Results Two nucleotide mutations for Col3A1 were found. One was in intron 15 while another in exon 30. The latter was an important mutation of a G to A transition(c.2209G＞A)resulting in alanine to threonine substitution at position(p.Ala698Thr).The mutations were inherited from proband of pedigree.Conclusion Genetic testing of Col3A1 mutation can facilitate an accurate diagnosis of Ehlers-Danlos syndrome.     

大鼠颈内动脉线栓法制备局灶性脑缺血模型及影响因素

缺血性脑血管症研究的开展需要合适的动物模型。颈内动脉内插入尼龙线的方法因不用开颅而且可以再灌注,损伤小,适用范围广,已被广泛用于制备局灶性脑缺血模型。但很多因素直接影响,本模型的成功率,给模型复制带来了较大的困难。文章就影响这一模型的各种因素进行了综述。     

骨髓间充质干细胞静脉移植治疗大鼠脑梗死的机制研究

目的 观察炎性因子和营养因子在静脉植入同种异体骨髓间充质干细胞(MSC)治疗大鼠脑梗死中的作用.方法 采用大脑中动脉远端阻塞法(dMCAO)制作大鼠脑梗死模型,假手术组开颅但不凝断血管、移植组于造模后1h经尾静脉移植1×106大鼠骨髓MSC,缺血对照组注射等量生理盐水.移植后48 h取脑用ELISA法检测皮层梗死核心区及纹状体促炎因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-6,抗炎因子IL-4、IL-10,以及营养因子IGF-1、GDNF、BDNF的含量.结果 同种异体骨髓MSC移植后48 h,和缺血对照组比较,移植组脑梗死区炎性因子IFN-γ、IL-6显著降低,TNF-α、IL-1β显著升高,纹状体区IL-10显著下降.移植组梗死区BDNF的含量比缺血对照组显著增高,纹状体区IGF-1的含量也比缺血对照组显著升高;GDNF在各组间无显著差异.结论 脑梗死后1h同种异体静脉移植骨髓MSC治疗dMCAO模型,其梗死后48 h时间点的治疗效果和MSC抑制炎性反应没有明确联系,而更可能和大鼠脑内营养性细胞因子增加有关.     

链脲佐菌素诱导的食蟹猴糖尿病模型中胰腺巢蛋白阳性细胞的变化

目的探讨链脲佐菌素（STZ）诱导的食蟹猴糖尿病模型中胰腺巢蛋白（nestin）阳性细胞分布及生物学特性的变化。方法1型糖尿病模型食蟹猴5只,长期血糖监测和静脉葡萄糖耐量实验评价该模型的可靠性及稳定性,细胞培养、免疫荧光染色对糖尿病猴和正常猴的胰腺组织进行分析。结果（1）nestin阳性细胞在正常猴胰腺组织中主要分布于胰腺导管,少量分布于胰岛周边;而在糖尿病猴则主要分布于残存的胰岛中。（2）糖尿病猴胰岛内的大部分nestin阳性细胞同时表达胰升血糖素。结论STZ在选择性地破坏胰岛β细胞的同时,可引起胰腺nestin阳性细胞的分布及表型的变化。     

慢病毒转染YFP基因在视网膜干细胞中的表达及变化

目的探讨慢病毒转染基因在视网膜干细胞（RSC）中表达的稳定性及对RSC细胞分化的影响。方法从出生1 d的小鼠眼中分离、培养RSC。用携带黄色荧光蛋白（YFP）的猫免疫缺陷病毒（FIV）转染RSC,分析YFP在分化和未分化RSC中的表达情况;用5溴脱氧尿苷（BrdU）标记正在进行有丝分裂的细胞,分析在慢病毒转染基因在RSC及其分化细胞的不同标记物表达。结果在RSC中FIV转染的YFP可长效表达53 d（传10代）,表达水平未明显衰减。转染YFP后RSC仍可呈克隆生长,YFP在BrdU阴性的分化细胞中迅速下调。结论慢病毒转染的YFP基因可以在RSC中长期稳定的表达,但随RSC的分化YFP的表达水平显著下降。