大鼠脂肪干细胞生物学特性的研究

目的研究大鼠脂肪干细胞的生物学特性，为外周神经组织工程应用提供实验基础。方法从F344大鼠的脂肪组织分离得到脂肪干细胞，体外培养并扩增，倒置相差显微镜观察其形态，绘制生长曲线研究增殖能力，流式细胞仪检测表面标志，核型分析研究遗传学性能，最后以5．溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）进行体外标记。结果脂肪干细胞形态以梭形为主，CD11b、CD45、CD49d、CD80、CD86表达阴性，MHCⅠ、MHCⅡ表达弱阳性，CD29、CD44、CD54的表达阳性。第11代以前的脂肪干细胞有较强的活力和增殖能力，体外培养至第10代，其细胞仍稳定为二倍体核型。BrdU可标记其核。结论脂肪干细胞具有较强的自我更新能力，其形态和表面标志均类似大鼠骨髓间充质干细胞。     

大鼠脂肪干细胞诱导分化为类许旺细胞的表型和功能特征

目的 研究大鼠脂肪干细胞(ADSCs)在体外分化为类许旺细胞的表型和功能特征,为外周神经组织工程应用提供实验基础.方法 采用β-巯基乙醇、全反式视黄酸、forskolin、血小板源生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和heregulin依次联合诱导,双重免疫荧光细胞化学法和Western blot鉴定神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和S-100蛋白等许旺细胞标志蛋白的表达,与原代背根神经节(DRG)感觉神经元共培养研究诱导后细胞的功能.结果 诱导后ADSCs形态类似许旺细胞.双重免疫荧光细胞化学法显示S-100和GFAP的最高表达率分别为(78.08±6.08)%和(72.38±6.43)%,双重表达率为(60.76±6.43)%.Western blot显示诱导后细胞同时表达这两种蛋白.诱导后细胞能明显增加DRG神经元的突起向外生长.结论 诱导后ADSCs的表型和功能特征证实大鼠ADSCs在体外可分化为类许旺细胞.     

Nestin特异性RNA干扰真核表达载体的构建及稳定株筛选

目的构建人nestin基因特异的RNA干扰质粒,为探讨抑制nestin基因表达对人黑色素瘤细胞生物学行为调控的研究奠定基础。方法分别用30、50、80 nmol/L干扰或80 nmol/L对照siRNA转染人黑色素瘤细胞株UACC903,48 h后用免疫荧光、RT-PCR和Western-blot鉴定nestin基因表达并筛选有效的序列,用有效或对照组序列的正义链和反义链,通过酶切、连接、转化和筛选,获得长期下调人nestin基因表达的慢病毒载体,并包装慢病毒感染人UACC903细胞,免疫组化和Western-blot鉴定干扰有效,以此获取nestin表达下调的UACC903细胞株。结果重组质粒成功转化高感受态大肠杆菌,经XhoⅠ和HPAⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳分析,结果表明寡核苷酸成功插入到预计位点,经测序鉴定,序列完全正确。干扰组或对照组慢病毒感染UACC903细胞后与对照组比较,干扰组mRNA和蛋白表达明显降低。结论成功构建了针对人nestin基因的特异性shRNA真核表达载体,转染细胞后可抑制nestin基因的表达,为进一步研究其基因功能奠定了基础。     

丹参酮ⅡA定向诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的:丹参酮ⅡA体外定向诱导成人骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞。方法:采用Ficoll-Paque液离心和贴壁法分离成人MSC,体外扩增,流式细胞仪检测MSC表面抗原表达,FGF-2对MSC增殖和分化的影响。采用含丹参酮ⅡA的无血清达乐伯克改良必需基本培养基(DMEM)诱导MSC分化为神经元样细胞,免疫组化鉴定神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF-M)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巢蛋白(nestin)的表达。结果:成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代可获得0.5×10⁶,15代可获得(2-3)×10¹²个细胞,流式细胞仪检测结果显示CD29、CD44、CD90、CD105、CD166表达阳性,CD11a、CD14、CD34、CD38、CD45、CD80、CD86为阴性。FGF-2促进hMSC生长,并且对MSC的分化能力基本没有影响。丹参酮ⅡA诱导后,MSC胞体收缩,突起伸出;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF-M、nestin表达阳性,GFAP阴性。结论:丹参酮ⅡA可以在体外诱导成人骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。     

人卵黄囊间质干细胞的分离纯化及诱导成脂的实验研究

目的:分离纯化及体外定向诱导人卵黄囊间质干细胞(YS-MSC)分化为脂肪细胞。方法:显微分离人卵黄囊, 经酶消化得到卵黄囊细胞, 卵黄囊细胞经贴壁培养、传代纯化得到人YS-MSC, 流式细胞仪检测YS-MSC表面抗原表达, 钙钴法测定碱性磷酸酶(AKP)活性;地塞米松、消炎痛、胰岛素定向诱导YS-MSC分化为脂肪细胞。油红O检测中性脂肪。结果:人卵黄囊间质干细胞易于分离、纯化, 体外培养增殖潜能大。卵黄囊间质干细胞CD29、CD44、CD166及CD105表达阳性, CD34、CD45和CD86为阴性;AKP弱阳性。卵黄囊间质干细胞经成脂诱导转化为大小不等的园形或椭圆形细胞, 可见胞浆内有少量微小脂滴形成, 随时间延长, 胞浆中脂滴相互融合, 胞核被挤于细胞的一侧, 经油红O染色脂滴染橘红色, 符合脂肪细胞的生物学特征。结论:人卵黄囊间质干细胞与成体间质干细胞表型一致, 在体外可以分化为脂肪细胞。     

慢病毒介导shRNA沉默巢蛋白表达对人黑色素瘤细胞转移特性的影响

摘要：目的应用慢病毒介导的RNA干扰技术,有效沉默黑色素瘤细胞株UACC903 巢蛋白（nestin）的表达,研究其对黑色素瘤
细胞转移能力的影响。方法以人nestin mRNA编码序列作为干扰靶点,以慢病毒基因PLL3.7 作为质粒载体,构建靶向人
nestin的shRNA表达质粒,另构建不针对任何已知mRNA的阴性对照shRNA表达质粒,分别感染UACC903细胞并流式分选获
得高纯度的nestin 干扰或对照组细胞。应用RT-PCR、免疫荧光及Western blotting 检测不同组别nestin 表达的变化。分别用
Transwell侵袭试验检测跨膜细胞的数量评估各组黑色素瘤细胞的侵袭能力,划痕法检测迁移能力改变。光镜观察各组细胞形
态变化,免疫荧光检测E-cadherin、N-cadherin 和β-catenin 在不同组别的表达变化。结果成功构建nestin shRNA慢病毒载体
nestin-RNAi-LV。RT-PCR 及免疫荧光结果显示干扰组UACC903 细胞nestin mRNA及蛋白表达水平较对照组显著降低。
nestin下调的UACC903细胞黏附、侵袭及迁移能力下降（P<0.05）。结论慢病毒介导的shRNA 能有效地静默食管癌细胞nestin
基因的表达,能抑制黑色素瘤细胞UACC903迁移。
     

人骨髓间质干细胞诱导成骨分化蛋白质的鉴定及生物信息学分析

目的：通过蛋白质组学和生物信息学技术建立人骨髓间质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells,hMSCs）诱导成骨分化蛋白表达谱,为进一步阐明 hMSCs 的成骨分化机制提供基础资料。方法：收集 hMSCs 诱导成骨分化的全蛋白,应用双向凝胶电泳（two-dimensional gel electrophoresis,2-DE）技术和图像分析软件进行蛋白质点的识别和检测,选择清晰表达的蛋白质点,应用基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectromety,MALDI-TOF-MS）和生物信息学方法进行蛋白质的鉴定和分析。结果：通过 MALDI-TOF-MS 和生物信息学鉴定了77种蛋白质;建立了hMSCs诱导成骨分化蛋白质表达谱;利用Gene Ontology对这些蛋白按分子功能和生物学途径进行了归类。结论：成功建立了hMSCs诱导成骨分化蛋白质表达谱;为进一步阐明 hMSCs 成骨分化的分子机制提供了基础资料,为进一步构建 hM－SCs 诱导成骨分化蛋白质表达数据库奠定了坚实的基础。     

三种不同型别小鼠骨髓来源间质干细胞的生物学特性分析

【目的】间质干细胞(MSC)是一种间质来源的多潜能基质细胞,目前人和多种动物来源的MSC均已被成功分离鉴定。然而由于小鼠骨髓MSC的分离相对人和其他物种更为困难,关于小鼠骨髓MSC的克隆分析结果也相对有限且结果不尽一致。为此,本研究拟进一步探讨小鼠MSC的体外分离方法,并对MSC克隆形成单位进行生物学特性分析。【方法】 取C57BL/6小鼠,冲洗股骨骨髓腔获得骨髓单个核细胞悬液,低密度接种培养,并通过有限稀释克隆挑选获得三种形态、生长特点不同的克隆形成单位(CFU)。采用流式分析技术对三种类型的CFU进行表型分析,并用油红O和茜素红分别进行成脂和成骨分化诱导鉴定。【结果】 低密度培养并结合克隆化培养分离技术成功获得C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞,并观察到偏圆形(MSC1)、长梭形(MSC2)以及纺锤形、多边形(MSC3)三种贴壁形态细胞类型;免疫表型分析显示,三种细胞均强表达Sca-1,不表达CD11b、CD45,部分表达CD90.2;体外诱导分化实验证实,MSC1仅具有向脂肪细胞分化的潜能,MSC2仅具有向成骨细胞分化的潜能;MSC3则具有成骨、成脂双向分化能力。【结论】 低密度培养并结合克隆化培养分离技术可成功分离小鼠骨髓间充质干细胞;小鼠MSCs是一种高度异质性的细胞群,其中可能含有多能MSC或单一分化方向的前体细胞等处于不同分化阶段的细胞类型。     

人参皂甙Rg1对体外微环境诱导人骨髓间充质干细胞成血管内皮样细胞分化的影响

目的 探讨人参皂甙Rg1在体外微环境诱导分化人骨髓间充质干细胞（human mesenchymal stem cells, hMSCs）成血管内皮样细胞的影响。 方法 采用模拟体内微环境的半透膜隔离非接触共培养的方法 体外诱导hMSCs向内皮细胞表型分化, 通过RT-PCR检测内皮细胞标志物血小板内皮黏附分子-1（CD31）、血管性血友病因子（vWF）、血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）mRNA的表达,免疫荧光染色检测CD31蛋白和血管内皮黏附分子-1（VCAM1）的表达。透射电镜观察诱导后细胞的超微结构鉴定诱导细胞的特征,并通过流式细胞仪检测诱导细胞CD31表达百分比。 结果 与成熟内皮共培养的骨髓基质干细胞具有微环境依赖性向内皮分化的能力。细胞培养第2周,开始出现形态学改变,胞体回缩,呈多角形改变。细胞培养第3周,细胞增殖速度明显加快,形态学上呈卵圆形或“铺路石”样改变;在基因水平上,RT-PCR显示经典内皮细胞标志物CD31、vWF、VE-cadherin mRNA的高表达;在蛋白水平上,免疫荧光染色CD31