甲型流感病毒株H1N1(09pdm)的分离及HA和NA基因分析北大核心CSCD

目的对成都某部人感染甲型流感病毒进行分离鉴定和基因突变分析。方法采集甲型流感患者咽拭子标本,通过MDCK细胞分离病毒毒株;采用免疫荧光法鉴定其感染细胞能力,采用基因分型特异性引物鉴定病毒亚型,PCR扩增血凝素基因(HA)和神经氨酸酶基因(NA)后测序,与NCBI数据库在线比对并利用MEGA软件构建系统发育进化树,分析突变位点。结果从甲型流感患者咽拭子标本中分离出1株流感病毒,经型特异性引物PCR鉴定为H1N1(09pdm)亚型,该毒株在37℃时对细胞致病力较强。免疫荧光检测到分离毒株感染细胞内甲型流感病毒核蛋白(NP)高表达,甲型流感病毒NP蛋白在细胞核和细胞质中均有大量分布。利用反转录PCR和测序获得该毒株HA和NA全长基因序列。在线比对及系统发育树分析显示,该毒株HA和NA序列与2017-2018流感季其他国家流行株同源性均>99%。对HA氨基酸突变位点进行分析,其序列的155位点存在组氨酸-酪氨酸(H-Y)点突变,该点突变也发生Influenza A/Hawaii/24/2018(H1N1)(MH245873)、Influenza A/North Carolina/19/2018(H1N1)(MH245873)和In-fluenza A/Missouri/51/2017(H1N1)(MH083792)毒株上。NA氨基酸序列与近期流行的毒株均相同。结论本起流感病毒株H1N1(09pdm)的HA、NA基因序列与同期其他国家流行株高度相似,但在HA氨基酸序列的155位点存在一个组氨酸-酪氨酸的点突变,其意义尚不清楚。     

腺病毒55型对人肠道细胞感染性的实验研究

  目的  明确腺病毒55型（HAdV-55）对人肠道细胞的感染性。  方法  体外培养人结直肠腺癌细胞Caco-2,以HAdV-3、7、14和55感染,免疫荧光法检测感染细胞内病毒蛋白的表达,荧光定量PCR方法检测不同时间点细胞内和上清中病毒DNA水平,采用腺病毒敏感细胞株HEp-2感染实验检测Caco-2细胞上清中感染性病毒颗粒水平。  结果  免疫荧光检测结果显示,感染48 h后,Caco-2细胞内HAdV-55病毒蛋白表达为阳性。HAdV-3、7、14、55在Caco-2细胞内均能持续复制和增殖,感染细胞内和上清中病毒DNA水平随感染时间的增加而升高,并且HAdV-55病毒DNA水平明显高于HAdV-3、7和14型。Caco-2上清中HAdV-55感染性病毒颗粒高于HAdV-3、7和14,差异有统计学意义（P<0.05）。采用低剂量病毒〔1×半数组织培养感染剂量（TCID₅₀）〕感染Caco-2细胞,HAdV-55感染孔细胞病变效应（CPE）比HAdV-3、7和14感染孔细胞显著。  结论  人呼吸道病毒HAdV-55对肠道细胞易感,感染水平高于其他常见的呼吸道感染腺病毒3、7和14型。     

成都某部一起感染Yamagata系乙型流感病毒血凝素基因分析

目的 分析成都某部感染乙型流感病毒遗传进化与血凝素（HA）基因突变位点。方法 通过犬肾上皮细胞（MDCK细胞）体外分离患者咽拭子标本流感病毒毒株,用PCR获取乙型流感病毒HA基因并测序,与NCBI数据库在线比对并利用MEGA 6.06软件构建系统发育进化树,分析突变位点。结果 通过MDCK细胞接种,分离出1株乙型流感病毒株,以感染病例咽拭子核酸及分离毒株的核酸为模板进行PCR扩增得到1 755 bp全长HA基因,获得的序列提交至GenBank数据库,获得基因登录号为MH236281。通过在线比对及系统发育树构建,该病例感染的病毒为Yamagata系乙型流感病毒。与乙型流感病毒Yamagata系的代表毒株Influenza B/Yamagata/16/88（GenBank No.M36105）相比,HA基因点突变碱基为57个;与世界卫生组织（WHO）推荐的疫苗株Influenza B/Utah/08/2014（GenBank No.KU592766）相比,突变碱基数为20个。进一步对HA1氨基酸突变位点进行分析,与四川地区往年流行株相比均发生了不同程度的突变,其中与2010年四川温江的分离株（GenBank No.KP461138）相比突变位点较少,仅有4处点突变;与WHO推荐的疫苗株Influenza B/Utah/08/2014相比,有2个氨基酸位点发生了变异,分别为L176Q和M255V,但突变没有处于HA1上的抗原决定簇区域。其中176位点是一个全新的突变,以往四川流行毒株、Yamagata系的代表毒株Influenza B/Yamagata/16/88及WHO推荐的疫苗株Influenza B/Utah/08/2014的HA1 176位点均为亮氨酸（L）,而本研究病例感染的乙型流感毒株HA1 176位点突变为谷氨酰胺（Q）。结论 成都地区驻地部队2017-2018流行季感染的乙型流感病毒HA基因已发生一些突变,但突变尚未造成抗原性的改变。