新生牛皮胶原蛋白海绵的制备及其体外细胞相容性

背景：现已证实,人肌腱、牛肌腱、鼠尾、猪皮、新生牛跟腱制备的胶原蛋白海绵有良好的细胞相容性。目的：采用新生牛皮提取胶原蛋白、制备生物医用胶原蛋白海绵,观察其与羔羊肾成纤维细胞的相容性。设计、时间及地点：对比观察实验,于2006-05/2007-02在西北民族大学生命科学与工程学院生物工程与技术国家民委重点实验室完成。材料：出生24h内宰杀的新生尕里巴牛犊皮,岷县黑裘皮羔羊肾原代成纤维细胞。方法：取新生牛犊皮,经脱毛、胃蛋白酶＋冰醋酸联合处理、盐析、透析、冻干后制备胶原蛋白海绵。将海绵与羔羊肾F3代成纤维细胞混悬液共培养,分别设胶原海绵材料组、阴性对照组（生理盐水）、阳性对照组（橡胶塞浸提液）。主要观察指标：应用倒置相差显微镜及JVC数码摄像系统观察、拍摄与记录细胞形态、生长情况。培养20,35d,对共培养物进行AO染色,观察细胞在胶原海绵中的增殖情况。培养65d后制石蜡切片,行苏木精-伊红染色,观察细胞在胶原海绵中的生长情况。结果：阳性对照组细胞培养24h细胞圆缩,不贴壁,3d后全部死亡。胶原海绵材料组与阴性对照组细胞形态均正常,细胞贴壁生长良好。随着培养时间的延长,海绵孔隙逐渐变小,细胞数量增加,形态变小,海绵外观从柔软、混浊变得挺拔、透明。AO染色显示培养20,35d的胶原海绵-羔羊肾成纤维细胞共培养物中有大量细胞存在,并且在胶原蛋白空隙中有大量细胞成团簇状生长。苏木精-伊红染色显示有大量蓝色细胞核和新生的红色胶原纤维。结论：制备的新生牛皮胶原蛋白海绵对岷县黑裘皮羔羊肾成纤维细胞有良好的相容性。     

兰州市猪戊型肝炎血清学及病毒基因型分析

目的 调查甘肃省兰州市猪戊型肝炎病毒(HEV)感染情况以及基因型.方法 收集兰州市部分地区猪血清,用ELISA诊断试剂盒分别检测HEV抗原和抗体;其中抗原阳性的血清,采用HEV ORF2引物进行套式逆转录聚合酶联反应(RT-PCR)扩增,对阳性扩增产物进行克隆和测序,并对序列进行分析,确定其基因型.结果 3月以下猪戊型肝炎病毒抗原、抗体阳性率分别为1.56%和90.27%,3个月以上分别为2.35%和86.99%,抗原、抗体水平在3月龄以上和以下二者中差异无统计学意义,抗原阳性血清共有22份,其中7份为HEV核酸阳性,其核苷酸序列与HEV 4型的同源性为82.2%～99.3%,分别为4a,4d和4f亚型.结论 兰州市猪群存在HEV感染,且为基因4型.     

新生牛跟腱胶原蛋白海绵与细胞的生物相容性

目的:采用新生牛跟腱制备生物医用胶原蛋白海绵,通过分别接种Vero细胞、天祝白牦牛胚胎皮肤原代细胞和岷县黑紫羔羊睾丸原代细胞至胶原蛋白海绵组织支架上,观察新生牛跟腱胶原蛋白海绵与3种细胞的生物相容性。方法:实验于2006-02/05在西北民族大学生命科学与工程学院生物工程与技术国家民委重点实验室完成。①用新生牛跟腱经冰醋酸、胃蛋白酶等消化,经盐析、透析及冻干等处理后,制备成胶原蛋白海绵。②在六孔板中,将Vero细胞、天祝白牦牛胚胎皮肤原代细胞和岷县黑紫羔羊睾丸原代细胞分别接种于经紫外线、臭氧灭菌后的胶原蛋白海绵上,经37℃体积分数为0.05的CO2恒温培养;并用另一组细胞在凯氏瓶中培养作对照实验。用奥林帕斯倒置相差显微镜及JVC摄像系统观察、拍摄与记录细胞生长情况,并于培养11d,用考马斯亮蓝和苏木精-伊红染色,证实相差显微镜观察的结果。结果:①胶原蛋白海绵制备结果:用新生牛跟腱制备得到具有一定孔隙度的胶原蛋白海绵,经紫外线、臭氧灭菌后可进行细胞培养。②3种细胞在胶原蛋白海绵上和六孔板底的生长情况:3种细胞接种后5h,在胶原蛋白海绵周围的六孔板孔底可看到Vero细胞已贴壁、伸展,个别细胞有分裂现象,在胶原蛋白海绵表面,隐约可见圆形细胞排列。Vero细胞和天祝白牦牛胚胎皮肤原代f2细胞接种72h、岷县黑裘皮羔羊睾丸原代f2细胞接种48h时,孔底细胞已经铺满单层,但与对照孔比较,生长速度较慢。②3种细胞用考马斯亮蓝细胞骨架染色和苏木精-伊红染色的结果:培养到第11天,3种来自不同动物、不同组织的细胞接种的胶原蛋白海绵支架孔中均有大量细胞良好生长,胶原海绵外观变得挺拔、透明、有韧性。结论:新生牛跟腱胶原蛋白海绵,对Vero细胞、天祝白牦牛胚胎皮肤原代细胞和岷县黑紫羔羊睾丸原代细胞无毒性,3种细胞均能在其上良好生长,但在体内是否会引起免疫排斥反应,还有待进一步研究。新生牛跟腱有望成为医用胶原蛋白海绵产品新的原材料。     

新生牛皮胶原蛋白海绵的制备及其体外细胞相容性

目的:采用新生牛皮提取胶原蛋白、制备生物医用胶原蛋白海绵,观察其生物学活性与细胞相容性。方法:实验于2006-05/2007-02在西北民族大学生命科学与工程学院生物工程与技术国家民委重点实验室完成。实验方法:①取出生24h内宰杀的新生尕里巴牛犊皮制备胶原蛋白海绵。②将新生牛皮胶原蛋白海绵与黑裘皮羔羊肾F3代成纤维细胞混悬液共培养,分别设胶原海绵材料组、阴性对照组(生理盐水)、阳性对照组(橡胶塞浸提液)。实验评估:①应用倒置相差显微镜观察细胞形态。②培养20,35d对细胞与胶原蛋白海绵共培养物进行AO染色观察细胞在胶原海绵中的增殖情况。③培养65d后制石蜡切片,行苏木精-伊红染色观察细胞在胶原海绵中的生长情况。结果:①细胞形态观察结果:阳性对照组细胞培养24h细胞圆缩,不贴壁,3d后全部死亡。胶原海绵材料组与阴性对照组细胞形态均正常,细胞贴壁生长良好。随着培养时间的延长,海绵孔隙逐渐变小,细胞数量增加,形态变小,海绵外观从柔软、混浊变得挺拔、透明。②细胞在胶原海绵中的增殖情况:吖啶橙-AO染色显示培养20,35d胶原海绵-羔羊肾成纤维细胞共培养物中有大量细胞存在,并且在胶原蛋白空隙中有大量细胞成团簇状生长。③细胞在胶原海绵中的生长情况:苏木精-伊红染色显示有大量蓝色细胞核和新生的红色胶原纤维。结论:制备的新生牛皮胶原蛋白海绵对岷县黑裘皮羔羊肾成纤维细胞有良好的生物相容性,无细胞毒性。     

罗格列酮和血清脂对绵羊前体脂肪细胞分化的影响

目的探讨罗格列酮(rosiglitazone,Ros)和血清脂(serum lipid,Lip)对绵羊前体脂肪细胞分化的影响及不同组织来源的前体脂肪细胞分化影响的差异。方法用不同浓度的Ros和(或)Lip培养绵羊皮下前体脂肪细胞和肾周前体脂肪细胞,通过测量3-磷酸甘油脱氢酶(GPDH)活性和油红O染色萃取液A值分析前体脂肪细胞的分化程度和脂肪细胞充脂量的变化,应用实时荧光定量PCR检测PPARγ和LPL mRNA的表达水平。结果 Ros和Lip提高细胞GPDH活性和脂滴的沉积量(P<0.05),上调LPL mRNA表达(P<0.05),最佳浓度分别为100nmol/L和20μL/mL;最佳浓度条件下Ros的诱导作用强于Lip(P<0.05),Ros显著提高了PPARγmRNA表达量(P<0.05),而Lip对PPARγmRNA的表达没有明显影响(P>0.05);Ros和Lip共同诱导与Ros单独作用之间没有明显差异(P>0.05);在相同诱导分化条件下,皮下前体脂肪细胞的分化程度高于肾周前体脂肪细胞(P<0.05)。结论研究结果表明Ros和Lip可促进绵羊前体脂肪细胞的分化,在相同条件下,皮下前体脂肪细胞的分...     

重组乙肝疫苗的研究进展

乙型病毒性肝炎（简称乙肝）是由乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）感染所致。HBV为嗜肝病毒,通过受感染者的血液或其他体液传播,引起肝细胞炎症、坏死、纤维化。乙肝分急性和慢性2种。急性乙肝在成人中90％可自愈,慢性乙肝可发展成肝硬化,甚至肝癌。乙肝在世界各国均有流行,我国属于高流行区。据统计,全球现有20多亿人感染过HBV,其中（3．5～4）亿人为慢性HBV携带者,我国有1．2亿人,     

新生牛跟腱胶原蛋白海绵与动物肾、睾丸、皮肤细胞的生物相容性

背景：随着新生牛血清的产业化，新生牛跟腱资源大量积累，使得利用其制备医用胶原蛋白海绵并产业化成为可能。 目的：采用新生牛跟腱制备胶原蛋白海绵，观察其与Vero 细胞、天祝白牦牛胚胎皮肤细胞和岷县黑紫羔羊睾丸细胞的生物相容性。 设计、时间、地点：重复测量观察，于2006- 02/05 在西北民族大学生命科学与工程学院生物工程与技术国家民委重点实验室完成。 材料：用出生24 h内的新生牛跟腱经冰醋酸、胃蛋白酶等消化, 经盐析、透析及冻干等处理后，制成胶原蛋白海绵。天祝白牦牛胚胎皮肤f2代细胞和岷县黑紫羔羊睾丸f2代细胞为自制，Vero 细胞为协和医科大学细胞中心提供。 方法：在6孔板中, 将3种细胞分别接种于经紫外线、臭氧灭菌后的胶原蛋白海绵上，于37 ℃、 体积分数为0.05 的CO2 恒温箱培养，同时设对照实验。 主要观察指标：相差显微镜观察接种5，12，24，72 h时 3种细胞在胶原蛋白海绵上和6孔板底的生长情况，接种11 d对共培养物行考马斯亮蓝、苏木精-伊红染色。 结果：接种后5 h, 在胶原蛋白海绵周围的6孔板底部可看到细胞已贴壁、伸展, 个别细胞有分裂现象, 在胶原蛋白海绵表面, 隐约可见圆形细胞排列。接种后48~72 h 时, 6孔板底部细胞铺满单层。接种后11 d，考马斯亮蓝和苏木精-伊红染色显示3 种共培养物中均有大量细胞良好生长, 胶原海绵外观变得挺拔、透明、有韧性。 结论：新生牛跟腱胶原蛋白海绵与上述3种来自不同动物、不同组织的细胞有很好的生物相容性，可做皮肤细胞、肾细胞和睾丸细胞的培养支架。     

MDCK悬浮细胞制备及流感病毒敏感性研究

目的 建立无血清悬浮培养MDCK细胞的方法,分析其传代、线性放大过程中的稳定性及增殖流感病毒的敏感性。方法 运用逐步降血清悬浮驯化法将贴壁培养型MDCK细胞驯化为无血清全悬浮培养型MDCK细胞;进一步分析其生长动力学特性、连续传代稳定性,在5L生物反应器中扩大培养;接种流感和禽流感病毒,测定不同时间HA效价、CCID₅₀滴度,分析其病毒敏感性。结果 成功将ATCC引进的贴壁培养型MDCK细胞驯化为无血清全悬浮培养型MDCK细胞(命名为MDCK-XF02细胞)并冻存;不同接种密度培养MDCK-XF02细胞最大增殖密度均达13.0×10⁶ cells/mL以上,且差异无统计学意义(P>0.05);连续传代培养过程中细胞形态和生长状况稳定,比生长速率差异无统计学意义(P>0.05);三个代次的MDCK-XF02细胞以2.0×10⁶ cells/mL接种于5 L生物反应器,细胞生长状态良好,倍增时间小于21 h,在批培养中细胞浓度高达(14.57±0.47)×10⁶ cells/mL,比生长速率分别为(0.027±0.012)h^-1、(0.028±0.013)h^-1、(0.027±0.013)h^-1(P>0.05);接种甲型流感病毒H1N1和H3N2,HA效价达到(6~7)log₂HA/25 μL、CCID₅₀为(4.35~4.68)lgCCID₅₀/mL;接种乙型流感病毒B/P和BX-35增殖效果更好,HA效价达到(9~10)log₂HA/25 μL,CCID₅₀为(6.38~7.31)lgCCID₅₀/mL。接种重组禽流感病毒H5亚型Re-5、Re-6、Re-10均能很好的增殖,HA效价达到(7~9)log₂HA/25 μL、CCID₅₀为(6.21~6.96)lgCCID₅₀/mL。结论 本研究获得一株具有自主知识产权的流感/禽流感病毒敏感的无血清悬浮培养型MDCK-XF02细胞株,实现了生物反应器高密度放大培养,为我国开展流感疫苗研究和生产提供细胞基质,也为其他动物细胞悬浮驯化提供参考。