弓形虫表面抗原SAG1基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 体外扩增弓形虫RH株膜表面抗原SAG1编码基因，构建原核表达质粒，并表达SAG1编码基因序列。方法 收集、纯化RH株速殖子，提取RNA，据已知的SAG1基因序列，在设计合成的1对引物中引入EcoRI和HindⅢ酶切位点。应用RT—PCR技术，扩增SAG1基因片段，插入原核表达质粒pET28a中，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，重组子经EcoRI和HindⅢ双酶切、PCR鉴定，转化宿主菌BL21，并以IPTG诱导表达。结果 从弓形虫RH株RNA中扩增出1011bp的SAG1基因片段，构建重组质粒pET28a／SAG1，酶切和PCR鉴定产物大小均与预期值相符；IPTG诱导，SDS—PAGE显示表达产物的大小约34．8kD．结论 成功地从弓形虫RH株RNA中获取SAG1基因，构建了pET28a／SAG1重组质粒并获得了高效表达，为免疫学诊断和蛋白质疫苗的研究创造了条件。     

皮肤利什曼病皮损内大量IL-10 mRNA表达提示常规治疗无效

利什曼原虫感染可引发治愈性皮肤利什曼病和粘膜及内脏利什曼病。临床症状取决于感染虫种及抗原的特异性免疫应答。对各种类型的美洲局部皮肤利什曼病(LCL)的皮损内细胞因子进行研究发现：由巴西利什曼原虫引起的LCL，IFN-7在皮损处有表达；而IL-4、IL-5、IL-10在粘膜利什曼病和播散     

与14-3-3ζ相互作用的蛋白Polo样激酶1的筛选与鉴定

目的:应用酵母双杂交系统筛选与14-3-3ζ相互作用的蛋白,进一步鉴定其与Polo样激酶1(Plk1)相互作用。方法:构建pGBKT7-14-3-3ζ诱饵表达载体,筛选HeLa细胞cDNA文库中与14-3-3ζ相互作用蛋白,进一步通过共转酵母、免疫荧光以及外源性和内源性的细胞免疫共沉淀实验验证两者的相互作用。结果:通过酵母双杂交系统筛选出的阳性相互作用蛋白中包括Plk1,进一步通过共转酵母,外源性和内源性的细胞免疫共沉淀实验证实两者的相互作用,免疫荧光实验证实两者共定位于有丝分裂过程中胞质分裂期的中体。结论:Plk1是高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在中体的成熟,有丝分裂期染色体的分离,胞质分裂以及DNA的损伤应答等环节发挥重要作用,其与14-3-3ζ的相互作用为14-3-3蛋白家族参与有丝分裂(M期)的调控提供了直接证据。     

Plk1330/597位丝氨酸磷酸化突变体对胞质分裂的影响

目的:研究Plk的330/597位丝氨酸的模拟磷酸化突变体Plk1S330/597D和不能磷酸化突变体Plk1S330/597A的绿色荧光融合蛋白在HeLa细胞中的定位以及对有丝分裂的影响。方法:将野生型Plk1-GFP质粒、模拟磷酸化型突变体Plk1S330/597D-GFP质粒和不能磷酸化突变体Plk1S330/597A-GFP质粒分别转染HeLa细胞株,免疫荧光法检测突变体融合蛋白Plk1S330/597D-GFP和Plk1S330/597A-GFP的细胞定位的定位,West-ern blot法检测上述突变体融合蛋白的表达。通过有丝分裂期的细胞计数,流式细胞仪检测细胞周期,观察转染突变体后HeLa细胞的有丝分裂进程。结果:模拟磷酸化突变体Plk1S330/597D和不能磷酸化突变体Plk1S330/597A的融合蛋白能正确表达。突变体在细胞有丝分裂过程中均能正确定位于动点和中体,但不能磷酸化突变体Plk1S330/597A融合蛋白对HeLa细胞的有丝分裂有明显的抑制作用,使胞质分裂期的细胞数量较对照组明显增多,产生G2/M期阻滞(P<0.01),并造成染色体分离滞后的现象。结论:Plk1激酶自身的磷酸化状态对其有丝分裂期功能具有重要作用,其330和597位丝氨酸去磷酸化能抑制细胞的有丝分裂,使细胞周期发生G2/M期阻滞。     

弓形虫ROP16I/IIIDNA疫苗不能诱导小鼠有效的保护性免疫

目的利用ROP16_I/III基因真核表达重组质粒免疫BALB/c雌性小鼠,检测小鼠体液免疫和细胞免疫,评估ROP16_I/III作为潜在的分子疫苗的价值。方法克隆Chinese 1型弓形虫ROP16_I/III, 将其插入真核表达载体pEGFP-C2中构建重组质粒pEGFP-ROP16_I/III,脂质体法转染T293细胞并观察体外表达。Western blotting分析鉴定。将36只SPF级小鼠随机均分为:①PBS组;②空质粒组;③pEGFP-ROP16 _I/III组。每2周肌注免疫1次(100 μg/只),共3次;于免疫前及每次肌注前1 d和末次免疫后2周收集小鼠血清,间接ELISA法检测血清抗弓形虫IgG。于末次免疫2周后取小鼠脾脏,分离淋巴细胞培养测细胞因子。剩余小鼠腹腔注射Chinese 1型弓形虫 Wh3株速殖子1 000个/只,观察小鼠攻击感染后的存活时间和存活率。结果真核表达载体构建成功,体外见到重组质粒pEGFP-ROP16_I/III在T293细胞的表达;pEGFP-ROP16_I/III末次免疫后血清中IgG水平及脾淋巴细胞细胞因子均无明显升高(P>0.05);攻击感染后,免疫组小鼠比对照组的存活时间无延长(P>0.05);生物信息学分析发现ROP16_I/III缺乏线性B细胞表位。结论Chinese1 型弓形虫的ROP16_I/III由于其分泌的定位和结构特点,不能诱导小鼠产生有效的抗Wh3株攻击感染的免疫保护。     

糖适平治疗2型糖尿病的临床疗效观察

目的观察糖适平治疗2型糖尿病的临床疗效.方法针对已确诊的2型糖尿病病人,分成糖适平组(1组),二甲双胍组(2组),二甲双胍+糖适平组(3组),治疗16周.结果①三组在FPG、PPG、HbAic均显示明显疗效(P＜0.05),尤3组更明显(P＜0.01);②将糖适平组又分成肾功能障碍组和非障碍组,结果二组降糖效果均良好(P＜0.05),未见肾功不良的副反应;③观察血压、血酯等,虽略有改善,但无统计学意义④＞60岁老年组疗效同非老年组;⑤未见发生低血糖.结论糖适平系2型糖尿病治疗的有效和安全的口服降糖药,轻、中度肾功能障碍和老年人使用仍安全有效.     

刚地弓形虫巨噬细胞迁移抑制因子基因敲除虫株的构建与鉴定

目的 构建并鉴定刚地弓形虫RH株巨噬细胞迁移抑制因子(Tgmif)基因敲除虫株。方法 设计刚地弓形虫RH株Tgmif的单向导RNA (sgRNA)和点突变引物，将pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT质粒定点突变为针对Tgmif基因的pSAG1::Cas9-U6::sg Tgmif质粒。构建含有Tgmif上游1 001 bp (Tgmif-up)、二氢叶酸还原酶-胸苷酸合成酶基因(dhfr-ts)和Tgmif下游1 011 bp (Tgmif-down)等3个片段的Tgmif供体质粒，从Tgmif供体质粒PCR扩增获得Tgmif供体DNA。将pSAG1::Cas9-U6::sg Tgmif质粒和Tgmif供体DNA混合后电击转染野生型刚地弓形虫RH株(RH_WT)速殖子，用乙胺嘧啶培养7 d，筛选获得稳定表达乙胺嘧啶抗性的虫株并进行单克隆筛选，PCR扩增dhfr-ts上、下游同源臂和Tgmif鉴定Tgmif基因敲除单克隆株(RH_ΔTgmif)。提取RH_ΔTgmif和RH_WT株虫体蛋白，蛋白质免疫...     

重组弓形虫14-3-3抗原用于弓形虫血清抗体的检测

目的　探讨重组弓形虫信号转导蛋白14- 3- 3(Toxo14- 3- 3)在弓形虫病免疫诊断中的价值。方法　根据弓形虫Beverly株猫肠上皮细胞增殖阶段的14- 3 -3编码基因,设计合成引物,自RH株速殖子基因组克隆Toxo14- 3 -3的ORF,克隆pET 28a质粒,转化大肠杆菌,获得表达产物并纯化融合蛋白,以此抗原包被反应板进行ELISA检测,并与粗制抗原及市售试剂进行比较。结果　对400份血清标本的平行检测,Toxo14 -3 -3抗原、粗制抗原和市售试剂盒的阳性率分别为2 5%、3 0%和3 .25%,三者之间差异无显著性(P>0 .05);三者之间的符合率为99 0%、98.8%和99 .0%,差异无显著性(P>0. 05 )。结论　重组Toxo14 -3- 3抗原检测弓形虫血清抗体具有潜在价值。     

弓形虫感染的免疫与基因诊断技术研究进展

弓形虫病是严重危害人类健康的人兽共患原虫病，临床表现缺乏特异性，且多为隐性感染，同时病原体又不易检测，因此建立快速、准确的实验室诊断方法尤为重要。本文就近年来弓形虫病实验室诊断技术的研究进展加以综述。     

弓形虫病的免疫学诊断进展

弓形虫病是全球广泛分布、对人类造成严重危害的人兽共患病。多见于艾滋病患者和肿瘤病人 ,而先天性弓形体病可导致流产、早产、畸胎、死胎等。因此 ,弓形虫病的防治和早期诊断已引起人们关注 ,必须寻找一种敏感而特异的早期诊断方法和诊断试剂。同国外的一些试剂盒相比 ,目前我国还缺少令人满意的诊断试剂盒。本文简要介绍近年弓形虫病免疫学检测有关的抗原及抗体研究