小鼠SLC基因真核表达载体的构建及表达

次级淋巴组织趋化因子(secondary lymphoid tissue chemokine,SLC)是重要的CC趋化因子,对多种免疫细胞特别是T淋巴细胞、树突状细胞(dendritic cell,DC)及NK细胞具有趋化作用.研究证实,SLC通过募集T淋巴细胞、DC和NK等免疫效应细胞到肿瘤组织、促进细胞因子的释放以增强肿瘤局部非特异性免疫以及抑制肿瘤血管生成等作用,达到其显著的抗肿瘤效果,是目前肿瘤免疫治疗的理想效应分子.为了进一步探索SLC在肿瘤基因治疗中的应用,我们构建了小鼠SLC基因的真核表达载体pVAX1-mSLC,为今后开展体内基因治疗肿瘤奠定基础.     

中国北方汉族人VISA基因相关位点单核苷酸多态性分析

目的〓〖HTK〗分析中国北方汉族正常人群VISA基因相关位点单核苷酸多态性(SNP)的分布特征。〖HTW〗方法〓〖HTK〗用DNA序列测定技术分析100例正常人VISA 基因上下游侧翼序列、外显子及外显子/内含子连接区的核苷酸序列。用核酸序列分析软件与Genbank的VISA基因序列比对，分析SNP的基因型、等位基因分布特点，并与高加索人种比较。〖HTW〗结果〓〖HTK〗发现8个SNP，其中5个为已知的SNP,新发现3个；NCBI数据库中有报道而本研究人群中未出现的SNP位点有6个。中国北方汉族正常人群与高加索人VISA基因多个相关位点基因型及等位基因分布有差异(P＜0.05)。〖HTW〗结论〓〖HTK〗本研究结果对了解中国北方正常人群VISA 基因多态性分布特征有一定的参考价值。     

人HMGB1基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达和纯化

目的  构建人高迁移率族蛋白B1（HMGB1）基因的原核表达载体,观察表达水平并纯化重组蛋白。方法  根据GenBank中人HMGB1基因序列,用OptimumGeneTM行密码子优化并合成目的基因,经PCR扩增,NdeⅠ和XhoⅠ双酶切,插入原核表达载体pQE-T7-2的相应位点,构建原核表达质粒pQE-T7-2/HMGB1。经菌落PCR、酶谱分析及序列分析鉴定重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blot印迹法鉴定重组蛋白,Ni NTA树脂亲和纯化目的蛋白。结果  成功构建人HMGB1克隆载体和表达载体;表达的目的蛋白约占菌体总蛋白的20%以上,Western blot法显示,重组蛋白能与抗HMGB1抗体和抗His抗体特异结合,亲和层析纯化后纯度达90%以上。结论  成功构建高效稳定的重组人HMGB1原核表达载体,获得纯化人HMGB1蛋白,为进一步研究HMGB1的功能奠定基础。     

重组共表达载体pSNAV2.0 HSV1tkIREShIL1Ra的构建及其在滑膜细胞中的表达

   目的引入内部核糖体进入位点（IRES）,构建HSV1 tk与hIL 1Ra双基因共表达AAV重组载体并检测其在滑膜细胞中的表达。方法PCR扩增HSV1 tk、IRES及hIL 1Ra基因片段,分别与pMD18 T simple载体连接,测序后,hIL 1Ra与HSV1 tk先后插入pMD IRES,构建重组质粒pMD HSV1 tk IRES hIL 1Ra,酶切出HSV1 tk IRES hIL 1Ra片段,克隆至AAV载体质粒pSNAV2.0上,构建成重组共表达质粒pSNAV2.0 HSV1 tk IRES hIL 1Ra,酶切鉴定后,用脂质体转染上述质粒至原代骨关节炎（OA）滑膜细胞,RT PCR法鉴定共表达质粒在滑膜细胞中的表达。结果酶切鉴定证实重组共表达质粒构建正确;RT PCR检测到转染后的OA滑膜细胞中表达HSV1 tk与hIL 1Ra。结论成功构建了重组共表达质粒pSNAV2.0 HSV1 tk IRES hIL 1Ra;重组质粒转染OA滑膜细胞后,能表达HSV1 tk与hIL 1Ra。这为OA的基因治疗研究提供了理论依据。     

人骨形态发生蛋白-2基因转染兔骨髓基质干细胞及其表达

目的探讨含有人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)cDNA的真核表达载体在兔骨髓基质干细胞(MSCs)中的转录及表达情况,为进一步进行多基因转染MSCs复合纳米仿生骨治疗骨缺损实验提供材料。方法用电穿孔方法将真核表达载体pIRES2-EGFP-hBMP2转染至兔MSCs中,荧光显微镜及流式细胞学检查观察转染效果、检测转染效率,定量RT-PCR方法观察hBMP-2cDNA在兔MSCs中的转录情况,免疫组织化学及westernblot方法检测hBMP-2蛋白表达情况,ALP活性定量测定检测hBMP-2蛋白功能。结果电穿孔方法将重组质粒转染至兔MSCs中,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪检测转染效率为(42.7±2.1)%,转染24h后定量RT-PCR方法检测到hBMP-2cDNA在兔MSCs中的转录片断,免疫组织化学观察到hBMP-2蛋白呈强阳性表达,westernblot方法可见18KDhBMP-2蛋白条带,转染组细胞ALP活性明显提高(P>0.05)。结论pIRES2-EGFP-hBMP2通过电穿孔方法导入兔MSCs,并在其中有效表达,发挥生物学作用。     

半乳糖凝集素-3在病毒性心肌炎小鼠心肌组织中的动态变化及临床意义

目的 探讨半乳糖凝集素-3(Gal-3)在小鼠柯萨奇病毒B3(CVB3)所致病毒性心肌炎(VMC)中的表达及其临床意义.方法 选取58只健康雄性Balb/C小鼠,随机分为VMC组(n=50)和对照组(n=8).VMC组小鼠腹腔接种半数组织培养感染剂量( TCID50)为10-5 L-1的Nancy株CVB3病毒液0.1mL,分别于接种第7、10、14、28天随机取8只处死;对照组小鼠腹腔接种不含病毒的eagle氏液0.1 mL,于第28天处死.光镜下观察小鼠心肌组织的病理变化并计算心肌病理积分;运用实时荧光定量PCR检测心肌组织中Gal-3 mRNA的表达,应用ELISA法检测外周血Gal-3水平,并与心肌病理积分作直线相关性分析.结果 1.与对照组小鼠比较,VMC组小鼠心肌组织Gal-3 mRNA的表达在第7天(0.91 ±0.64 vs 10.09 ±2.78)、第10天(0.91 ±0.64 vs 12.49 ±6.08)和第14天(0.91 ±0.64vs2.86±2.90)均明显增高(Pa＜0.05).2.与对照组小鼠外周Gal-3水平(5.27±1.11)比较,VMC组小鼠外周血Gal-3水平在第7天(9.70±2.39)、第10天(8.98±3.03)和第14天(7.73±1.88)也均明显增高(Pa＜0.05).3.小鼠心肌组织中Gal-3 mRNA与外周血中Gal-3表达水平均与心肌病理积分呈直线正相关(r=0.77、0.69,Pa＜0.05).结论 Gal-3参与VMC的发生与发展,且与VMC的病情严重程度有关,可作为VMC新的检测指标.     

先天性心脏病并肺动脉高压患儿骨形成蛋白Ⅱ型受体基因新突变

目的探讨骨形成蛋白Ⅱ型受体(BMPR2)基因外显子突变与先天性心脏病并肺动脉高压(CHD/PAH)之间的关系。方法收集66例无血缘关系的CHD/PAH患儿。均为汉族;男39例,女27例;VSD 25例,复杂CHD 20例,PDH 16例,ASD 5例。另收集66例健康儿童作为健康对照组。采集所有对象外周静脉血,提取基因组DNA,PCR方法扩增BMPR2基因的13个外显子编码序列后,对扩增产物纯化后进行测序,测序峰图用Sequencher 4.7 Demo软件进行分析,与GenBank人BMPR2的基因序列进行比对。结果 1.病例组检出1例部分性房室隔缺损并二尖瓣前叶裂、PAH患儿BMPR2基因外显子8发生错义突变,经数据库查对,该突变为一新的突变位点,而其余病例与健康对照组均未发现相同位点发生碱基突变;2.病例组9例和健康对照组10例儿童BMPR2基因编码区有一单核苷酸多态位点,即c.2811G>A,2组间差异无统计学意义。结论在我国汉族CHD/PAH患儿中首次发现BMPR2基因外显子8发生错义突变,该新的错义突变可能与CHD并PAH形成有关。     

支气管哮喘患者ADAM33基因S2位点多态性的研究

目的检测ADAM33基因S2位点多态性在支气管哮喘患者中的分布频率,探讨S2位点单核苷酸多态性与支气管哮喘的相关性。方法采用等位基因特异性聚合酶链反应（AS—PCR）技术及DNA测序的方法,对126例哮喘患者及121例健康人进行ADAM33基因S2位点单核苷酸多态性分析。结果ADAM33基因S2位点在哮喘组和对照组中基因型分布均符合Hardy—Weinburg平衡定律;ADAM33基因S2位点3种基因型（CC、CG、GG）在哮喘组分布为64例（50．8％）、45例（35．7％）、17例（13．5％）,在对照组分布为72例（59．5％）、44例（36．4％）、5例（4．1％）,两组比较有统计学差异（x^2=6．929,P〈0．05）。哮喘组与对照组C及G等位基因频率比较差异有显著性（x^2=5．122,P〈0．05）。结论ADAM33基因S2位点在支气管哮喘人群中存在CC、CG、GG多态性;ADAM33基因S2位点多态性与支气管哮喘有明显相关性。     

布地奈德降低哮喘小鼠肺中去整合素-金属蛋白酶33表达

去整合素-金属蛋白酶33(a disintegrin and metalloproteinase,ADAM33)与哮喘气道的损伤修复有着密切的关系。布地奈德(budesonide,BUD)是临床治疗哮喘应用较广泛的糖皮质激素,其能否通过干预ADAM33的表达来干预哮喘气道重塑,目前相关的报道较少。本研究观察BUD干预对慢性哮喘小鼠模型中肺组织ADAM33表达水平的影响,探讨其对小鼠哮喘气道重塑的干预作用。     

尾加压素Ⅱ基因多态性与多囊卵巢综合征相关性的研究

目的 探讨尾加压素Ⅱ(UTS2)基因多态性与多囊卵巢综合征(PCOS)发病的关系.方法 用熔解温度不同的基因分型法.检测PCOS患者101例(PCOS组)及其父母202名和105名健康妇女(对照组)UTS2基因rs228648、rs2890565位点单核苷酸多态性(SNP),并检测基础状态下FSH、LH、睾酮、空腹血糖、空腹胰岛素水平.结果 PCOS组的UTS2基因rs228648 A/G多态性位点与对照组比较,基因型与等位基因频率均无明显差异,两组的SNP rs2890565基因型频率差异有统计学意义(P<0.05),PCOS组A等位基因频率明显高于对照组(P<0.05).传递不平衡检验(TDT)显示,SNP rs228648A/G在杂合子父母的2个不同等位基因无优势传递(P>0.05),而rs2890565 A/G在杂合子父母A等位基因优势传递(P<0.05).PCOS组UTS2基因SNP rs228648 GG基因型较携带A等位基因的PCOS患者稳态模型评估的胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)明显增高(P<0.05).SNP rs2890565从和AG基因型空腹血糖、空腹胰岛素较GG基因型明显增高,从基因型HOMA-IR较GG基因型明显增高(P<0.05).结论 UTS2基因SNP rs228648 A/G多态性与PCOS无相关性,但与胰岛素抵抗存在关联.UTS2基因SNP rs2890565可能在PCOS的遗传易感性中起一定作用,A等位基因可能与PCOS的发生有关.