单细胞转录组测序技术在人精原干细胞研究中的应用

精原干细胞的自我更新、增殖与分化对于维持精子发生至关重要。然而,调控这一过程的分子机制尚未完全阐明。精原干细胞具有不同细胞亚型,其在精子发生过程中扮演不同角色。单细胞转录组测序技术提供有效的手段,揭示各精原细胞亚型及其转录组水平和生物学功能变化,为精原干细胞的分子机制研究提供新思路。     

不同病因的非梗阻性无精子症显微镜下睾丸取精术结局研究（附1355例报道）

目的：分析不同病因的非梗阻性无精子症（non-obstructive azoospermia,NOA）患者经显微镜下睾丸取精术（microdissection testicular sperm extraction,micro-TESE）的治疗结局。方法：回顾性分析上海市第一人民医院2015年3月—2022年1月1 355例接受micro-TESE的患者,病因/危险因素包括克氏综合征（Klinefelter syndrome,KS）、Y染色体AZFc缺失、隐睾、腮腺炎性睾丸炎、放化疗、精索静脉曲张以及特发性NOA,研究分析各组患者精子获取率（sperm retrieval rate,SRR）,并比较各组取精成功的妊娠结局。结果：NOA患者的总体SRR为26.2%(355/1 355),其中腮腺炎性睾丸炎SRR最高（75.9%,22/29）,其次分别为隐睾（70.5%,43/61）、Y染色体AZFc缺失（55.6%,30/54）、KS(47.6%,71/149)、特发性NOA(18.6%,167/897)、放化疗（15.4%,2/13）,精索静脉曲张SRR最低（13.2%,20/152）...     

人精原干细胞分离、培养与鉴定

目的 :分离、鉴定和培养人精原干细胞(SSC),以获得纯化、富集的人SSC并为其研究与应用奠定基础。方法:通过免疫荧光方法检测睾丸组织中CD90表达情况;应用两步酶消化和差速贴壁法分离人睾丸生精细胞,以CD90为人SSC标志,用免疫磁珠分选技术(MACS)对人睾丸生精细胞进行分选,并利用RT-PCR和免疫细胞化学对分选所得CD90+细胞进行鉴定;同时用SG培养液将CD90+细胞与支持细胞进行体外共培养。结果:MACS分选所得CD90+细胞大小、形态特征较为均一,RT-PCR检测其表达人SSC标记性基因,免疫荧光检测其高表达人SSC特异标记GFRA-1、GPR125和UCHL-1,阳性率达90.5%,其在SG培养液中与支持细胞共培养14 d后仍可保持良好活性。结论:CD90可作为人SSC特异性标志之一,结合差速贴壁和MACS可高效分选人SSC,分选所得SSC可在SG培养液中进行体外培养。     

新型超微量冷冻麦管:微量精子冻融安全有效新载体(附83例报道)

目的探讨新型超微量冷冻麦管(LSL管)冻存微量精子的冻融结果。方法回顾性分析83例严重男性不育症患者采用LSL管冻存精子的冻融结果,观察其中23对夫妇因男性因素解冻LSL管精子行卵胞质内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)的妊娠结局。结果不同来源的微量精子采用LSL管复苏后89.5%(94/105)可见活动精子,进入辅助生殖周期的标本可使用率为73.9%(17/23)。在18个ICSI周期中,受精率、卵裂率、可用胚胎率和优质胚胎率分别为78.0%、92.5%、62.7%和40.6%;种植率、临床妊娠率和累计活产率分别为31.1%、52.5%和55.6%。获得的所有12个活产儿均未见出生缺陷。结论 LSL管是一种可用于微量精子冷冻保存的安全有效新载体,可广泛使用于辅助生殖治疗。     

染色体多态性对男性生精能力及生育结局的研究

目的探讨染色体多态性对男性生精能力和生育结局的影响。方法选择3 203例男性不育者(不育组)和4 893例捐精初筛合格者(捐精组)进行回顾性队列研究,其中根据精液精子数量将不孕组患者分为精子正常组、少精子症组、无精子症组。检查并比较各组的精液常规、染色体核型、Y染色体微缺失。对有多态性的捐精者和患者进行随访,了解他们的生育结局。结果不育组和捐精组多态性发生率分别为4.62%和3.78%,差异无统计学意义(P0.05)。不育组的Y异染色质长度减少(Yqh-)发生率(0.59%)高于捐精组(0.27%),差异有统计学意义(P=0.022),且随着精子数量减少Yqh-发生率明显增加(精子数量正常组为0.15%,少精子症组为0.22%,无精子症组为0.99%),差异有统计学意义(精子正常组与无精子症组P=0.033;少精子症组与无精子症组P=0.027)。携带有Yqh-的患者Y染色体微缺失检出率为56.25%(9/16),显著高于其它类型人群(P0.001)。不育组中弱精子者和畸形精子者的多态性发生率分别为3.92%、3.96%,同捐精组(3.78%)相比,差异无统计学意义(P0.05)。随访捐精组和不育组有多态性人群的配偶,结果其自然流产率分别为6.25%(3/48)和6.67%(2/30),差异无统计学意义(P0.05),且无1例发生子代出生缺陷。结论除Yqh-部分伴随无精子因子(AZF)缺失可导致精子发生障碍,使男性生育力下降,其它类型多态对男性生育无明显影响。     

高原环境对世居藏族与移居汉族男性精液特征的影响

目的:探讨世居高原藏族和移居高原汉族生育与不育人群精液参数特征,分析高原环境对男性生育力的影响。方法:从不育门诊收集男性不育人群1 563例,其中世居藏族698例,移居汉族865例;生育人群为西藏阜康妇产儿童医院员工,共56例,其中世居藏族33例,移居汉族23例。行精液常规分析、精子DNA完整性检测、外周血生殖激素测定,分别比较世居藏族及移居汉族不育人群生育力特征和生育人群主要精液参数和生殖激素水平。结果:在两组不育人群中,世居藏族较移居汉族人群无精子症、严重少精子症、精液粘稠度异常发病率显著增高(分别为5.87%vs 2.89%、3.15%vs 1.73%,P0.05;43.12%vs 25.89%,P0.01),而精液参数正常者和少精子症、严重弱精子症、严重畸形精子症患者百分率无明显差异(分别为81.08%vs 87.39%、5.44%vs3.93%、4.44%vs 4.04%、4.58%vs 6.59%,P均0.05)。在已育人群中,世居藏族与移居汉族在年龄[(32.42±4.82)岁vs(34.57±6.01)岁]、精子浓度[(143.69±85.74)×106/ml vs(155.11±82.56)×106/ml]、直线运动速度(VSL)[(25.74±3.94)μm/s vs(27.24±3.46)μm/s]、正常形态精子百分率[(8.22±4.35)%vs(7.28±2.46)%]、精子DNA碎片指数(DFI)[(25.49±7.88)%vs(24.52±11.86)%]、TT[(17.97±2.98)nmol/L vs(15.72±6.38)nmol/L]、FSH[(5.51±1.62)IU/L vs(4.17±2.08)IU/L]等方面均无统计学差异(P均0.05);移居汉族男性精子活动率明显高于世居藏族男性[(79.75±14.67)%vs(66.58±17.21)%,P0.05],而曲线运动速度(VCL)[(60.97±2.71)μm/s vs(71.14±82.13)μm/s,P0.05)]、LH[(4.28±1.20)IU/L vs(5.84±1.15)IU/L,P0.05]均较世居藏族低。结论:移居高原汉族人群在习服高原低氧环境过程中,其精子浓度、精子活力等发生适应性改变,且无精子症、严重少精子症等发病率低于世居藏族。     

麒麟丸对无精子症模型小鼠睾丸生精功能的影响

目的:探讨麒麟丸是否促进无精子症模型小鼠生精功能恢复,揭示其调控睾丸生精功能的机制。方法:取15只4周龄ICR雄性小鼠,随机分成模型组、麒麟丸低剂量组、麒麟丸高剂量组,每组5只。采用白消安建立无精子症小鼠模型。建模后麒麟丸组每天给予不同剂量麒麟丸灌胃给药[低剂量组和高剂量组分别为2 000、8 000 mg/(kg·d)],模型组予正常饮食处理,28 d后颈椎脱臼法处死小鼠。HE染色检测小鼠附睾和睾丸组织显微结构,Western印迹检测小鼠睾丸中各级生精细胞、支持细胞和间质细胞特异性标志物表达情况,免疫荧光染色检测睾丸内这些标志物的定位与表达情况。结果:模型组小鼠睾丸中各级生精细胞数量明显减少,大多数附睾管中未见精子; Johnsen评分(5. 2±0. 5)分。麒麟丸高剂量组小鼠生精小管腔内生精细胞排列紧密、层次分明,附睾管腔中见大量精子,未见非精子细胞成分; Johnsen评分(9. 4±0. 6)分。麒麟丸低剂量组小鼠睾丸中各级生精细胞数量相比较模型组有所提升,但是对比高剂量组仍明显减少,部分附睾管中可见精子; Johnsen评分(7. 6±0. 6)分。Johnsen评分模型组显著低于麒麟丸高、低剂量组(P 0. 01),而且麒麟丸高、低剂量组间也有统计学差异(P 0. 05)。Western印迹结果显示,支持细胞标志物GATA4、WT1、SCF、BMP4的表达水平模型组均显著低于麒麟丸高、低剂量组(P 0. 01),高剂量组显著高于低剂量组(P 0. 05或0. 01);精原干细胞和未分化精原细胞标志物UCHL1、STRA8、NGN3、PLZF 3组小鼠间无显著差异;精母细胞标志物DMC1、SYCP3模型组也均显著低于麒麟丸高、低剂量组(P 0. 05或P 0. 01),高剂量组显著高于低剂量组(P 0. 05或P 0. 01)。免疫荧光染色结果显示,SYCP3的表达与Western印迹结果一致; Ki67荧光信号分布在精原细胞,其荧光信号强度模型组低于麒麟丸高、低剂量组;精子顶体标志物PNA主要分布在生精小管内,模型组小鼠没有出现明显的点状信号,麒麟丸高、低剂量组可见大量的荧光信号。结论:麒麟丸可能是通过改善睾丸中支持细胞的功能,从而促进精原细胞进入减数分裂,增加精子的生成。     

小鼠Y染色体编码基因mRNA在成熟精子中保留情况的研究

目的:探讨成熟精子中Y染色体编码基因mRNA的保留情况。方法:从小鼠Y染色体长臂和短臂上选择10个重要基因,应用RT-PCR方法分析这些基因在成熟精子、睾丸、雄脑和雌脑中的表达。结果:所选基因在睾丸中均有表达,而成熟精子只有Dby基因表达。结论:成熟精子对所选的10个Y染色体编码基因mRNA选择性地保留,在小鼠成熟精子中仅仅保留了Dby的mRNA。