不同血清型腺相关病毒对小鼠膝关节软骨细胞感染效率的比较研究

目的:比较不同血清型腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)对小鼠膝关节软骨细胞的感染效率,寻找理想的膝关节软骨细胞基因编辑工具。方法:选取4周龄C57BL/6雄鼠45只,体重(14.3±0.2) g,根据右侧膝关节腔注射试剂(6μl)的不同分为以下9组,每组5只。对照组(生理盐水),维2组(维真生物AAV2,滴度为1×10~(13)vg/ml),维5组(维真生物AAV5,滴度为1×10~(13)vg/ml),维6组(维真生物AAV6,滴度为1×10~(13)vg/ml),维7组(维真生物AAV7,滴度为1×10~(13)vg/ml),维8组(维真生物AAV8,滴度为1×10~(13)vg/ml),维9组(维真生物AAV9,滴度为1×10~(13)vg/ml),汉DJ组(汉恒生物AAV2-DJ,滴度为1×1012vg/ml),汉5组(汉恒生物AAV5,滴度为1×1012vg/ml)。所有病毒过表达绿色荧光蛋白(GFP)。在注射30 d后取膝关节,于体视显微镜下大体观察软骨损伤情况后,做10μm冰冻切片,采用荧光显微镜观察膝关节软骨和半月板绿色荧光分布情况。结果:体视显微镜观察结果表明,本研究采取的膝关节腔注射方法对小鼠软骨无明显损伤。组织切片的荧光观察显示,经不同血清型AAV注射后的小鼠膝关节软骨细胞均发出较强的绿色荧光,荧光强度分析中以维2组和维7组软骨和半月板的荧光强度最高,平均光密度值分别为0.077±0.020和0.061±0.022,上述2组与其他各组间比较差异有统计学意义。结论:通过在体膝关节腔注射AAV可成功感染小鼠膝关节软骨细胞,AAV2和AAV7对膝关节软骨组织感染效率高且特异性较强,该方法可作为膝关节软骨细胞基因编辑的有效工具。     

脊柱轴线力学失稳诱导椎间盘退变小鼠模型的建立及评价

目的:建立一个操作简单、重复性好、可靠性高的脊柱轴线力学失稳诱导椎间盘退变的小鼠模型并对其进行评价。方法:通过手术去除小鼠棘上和棘间韧带致其脊柱轴线力学失稳来诱导构建椎间盘退变(IDD)模型,并于造模后不同时间点收集腰椎样本,通过番红O/固绿染色观察IDD过程中椎间盘形态学改变,免疫组化法检测椎间盘基质代谢相关蛋白(Col1,Col2和基质降解酶Mmp13)和Hif信号关键蛋白(Hif1α,Vegf)在椎间盘组织中的表达模式变化,对模型进行评价。结果:椎间盘番红O/固绿染色表明,对照组椎间盘组织形态结构完整,内外层纤维环排列整齐,细胞外基质染色均匀;而IDD模型组纤维环出现撕裂、纤维排列紊乱等状况,番红O染色变浅。免疫组化结果表明,对照组椎间盘纤维环中Col1,Col2,Mmp13在正常椎间盘中均有表达。与对照组比较,模型组纤维环中Col2表达显著降低,而Col1和Mmp13表达均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。Hif信号检测发现,在正常椎间盘组织中,Hif1α于外侧纤维环中呈低表达,后期表达逐渐降低,而Vegf表达于纤维环和髓核组织;与对照组比较,造模4周IDD模型组纤维环组织中Hif1α表达升高,同时伴随Vegf表达的增加,尤其是在内侧纤维环区域,而造模6~8周后,Vegf在纤维环内外侧的表达进一步升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:应用去除棘上和棘间韧带方式使小鼠脊柱轴线力学失稳,成功建立力学异常IDD小鼠模型。该模型操作简单、重复性好,可为进一步揭示IDD的病理发生机制及临床治疗提供可靠的动物模型。