骨形成蛋白2基因修饰的老年大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力的研究

目的观察年龄因素对骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells, MSCs)成骨分化能力的影响;了解基因治疗对老年大鼠MSCs成骨分化能力的影响. 方法 1月龄(幼年组)、9月龄(成年组)及24月龄(老年组)雄性Wistar大鼠各6只,取MSCs经体外分离、培养及携带骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)基因的腺病毒载体(Ad-BMP-2)转染后,定量检测BMP-2、碱性磷酸酶(alkaline phosphate,ALP)表达,以及成骨细胞标志性蛋白:Ⅰ型胶原、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)和骨桥素(osteopontin, OPN)的表达.将转染的各组MSCs分别与磷酸三钙(tricalcium phosphate, TCP)复合后植入裸鼠体内,3周后取材,比较各组诱导异位成骨能力. 结果 ELISA检测表明BMP-2基因修饰的MSCs可以有效表达BMP-2,且表达量在各年龄组间差异无统计学意义(P>0.05);各组ALP于诱导后第9天达高峰,但组间差异均无统计学意义(P＞0.05);诱导后第7天,RT-PCR半定量检测示各组均有成骨细胞特征性蛋白,即:Ⅰ型胶原、OPN及BSP的明显表达,表达量在各组间差异无统计学意义(P>0.05);BMP-2基因转染的MSCs与TCP复合后可诱导裸鼠体内异位成骨,各组成骨量差异无统计学意义(P>0.05). 结论 BMP-2基因修饰的老年大鼠MSCs可以恢复成骨分化能力,基因治疗可能为老年性骨骼疾病提供一种新的治疗途径.     

人骨形态发生蛋白-2基因转染脂肪源性间充质干细胞的成骨研究

目的 探讨人骨形态发生蛋白-2（hBMP-2）基因修饰的人脂肪源性间充质干细胞（ADSCs）的成骨能力及基因转染对ADSCs成骨分化的生物学调控。方法 流式细胞技术鉴定从人脂肪组织中提取的细胞为间充质来源的干细胞。将ADSCs转染hBMP＋2基因，免疫沉淀＋Western blotting法和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测hBMP-2表达，确定hBMP-2表达量及表达稳定性，碱性磷酸酶（ALP）染色、ALP定量测定、钙结节染色及RT—PCR分析hBMP-2基因转染对ADSCs向成骨细胞转化的调控，并将转基因细胞注入裸鼠股部肌内，通过X线及组织学检查观察体内成骨情况。结果 流式细胞术证实从脂肪中提取的细胞为间充质来源的干细胞。转基因后免疫沉淀＋Western blotting法和ELISA法显示转染hBMP-2的ADSCs具有较高且稳定的hBMP-2的表达，转染21d后表达量无明显降低。ALP染色、ALP定量测定、钙结节染色及RT—PCR发现转基因ADSCs向成骨细胞方向发生分化。裸鼠肌内注射转基因细胞后2周即显示有异位骨形成，4周明显增多，对照组无骨组织形成。结论 转染hBMP-2基因的ADSCs在持续稳定高表达目的蛋白的同时，自身向成骨细胞发生分化，并在裸鼠体内形成异位骨。因此，ADSCs有望作为新的基因工程种子细胞。     

腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2基因修复兔桡骨缺损

目的 评价腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2（Adv-hBMP-2)基因对兔骨髓间充质干细胞（BMSCs)的诱导成骨活性及修复长骨干骨缺损的效果。方法 （1）抽取兔骨髓行BMSCs培养，经Adv-hBMP-2转染后分别行免疫沉淀加Western印迹法和碱性磷酸酶（ALP）检测及von Kossa染色，并行裸鼠肌内诱导成骨试验。（2）修复兔桡骨缺损：15只兔30侧、1.5cm的骨缺损分为Adv-hBMP-2转染BMSCS加珊瑚及胶原载体组、β半乳糖苷酶（Adv-βgal)转染BMSCs加载体组、未转染BMSCs加载体组、载体组和未治疗组，术后行X线、组织学检查。结果 （1）Adv-hBMP-2组BMSCs表达hBMP-2，其ALP活性升高，并有钙结节形成,裸鼠肌内注射后有异位成骨。（2）在兔桡骨缺损处，Adv-hBMP-2转染组有明显骨痂形成，5个组的愈合率分别为4／5、2／5、2／5、0／5、0／5。结论 Adv-hBMP-2基因转染的BMSCs是修复骨缺损的好方法。     

骨形态发生蛋白2基因转染的骨髓间充质干细胞修复羊胫骨干骨缺损

目的 评价腺病毒介导的人骨形卷发生蛋白2(Adv-hBMP-2）基因转染的羊骨髓间充质干细胞(BMSCs)对长骨干骨缺损的修复效果．方法 22只羊，体重18．1～29．5kg．制造羊胫骨干骨缺损(2．1cm)．分为4组：Ⅰ组．Adv-hBMP-2转染BMSCs组(8只)；Ⅱ组．腺病毒介导的β半乳槠苷酶(Adv-βgal)转染BMSCs组(6只)；Ⅲ组，未转染BMSCs组(6只)；Ⅳ组，未治疗组（2只)。细胞自身分泌的细胞外基质作为细胞载体。分期行X线、计量组织学检查和生物力学测定。结果 X线检查示Ⅰ组的羊胫骨干骨缺损内有明显骨痂形成；24周，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组的愈合率分别为6/7、1／5、2／5及0／1，X线疗效评分显示Ⅰ组与Ⅱ、Ⅲ组的评分比较．差异有显著性意义。组织学检查显示，与其它组相比．Ⅰ组的新生骨量最多，并有皮质骨形成。生物力学测试示Ⅰ组的力学强度最大。结论 Adv-hBMP-2基因转染的BMSCs在缺乏骨传导性支架的条件下可修复长骨干骨缺损。     

β-TCP/HAP双相煅烧骨的制备及其在BMP-2基因给药中的应用

研制了一种具有天然骨结构的β-磷酸三钙(β-TCP)／羟基磷灰石(HAP)双相可吸收煅烧骨(CB)，并评价其在BMP-2基因给药中作为骨髓间充质干细胞(BMSCs)载体的效果。方法 包括制备双相CB，行胶原表面涂层、X线衍射分析、扫描电镜观察、生物力学测定，并和BMP-2基因转染的BMSCs复合植入裸鼠皮下行诱导成骨试验和羊体内吸收时间的检测。X线衍射分析发现典型的HAP和β-TCP的双相波型。扫描电镜观察显示孔径和孔隙率均与松质骨相似，胶原表面涂层后细胞在材料表面贴附优良。该CB有一定的生物力学强度和合适的生物降解性。双相CB加Adv—hBMP—2转染的BMSCs能诱导裸鼠皮下大量骨痴形成，在BMP—2基因给药中是良好的细胞载体。     

β-半乳糖苷酶在体内外成骨细胞中的表达

目的 研究β—半乳糖苷酶(β—gal)在成骨细胞中的表达状况，为阐明MorquioB综合征的发病机制提供依据。方法 裸鼠各器官和骨组织标本行X-gal染色检测。抽取羊和人骨髓行骨髓基质细胞(BMSCs)培养，分为4组：I：Adv-hBMP-2转染组；Ⅱ：Adv—β—gal转染组；Ⅲ：未转染组；Ⅳ：地塞米松诱导组。分别行X-gal染色和RT-PCR检测β—gal的表达。结果 裸鼠骺板两侧、骨膜内面及松质骨的成骨细胞和破骨细胞可见多量β—gal的表达。未转染BMSCs组有少量β—gal的表达，其他3组细胞的β—gal表达增高。结论成骨细胞和破骨细胞可表达多量β—gal，该两种细胞的β—gal缺乏可能是MorquioB综合征骨骼异常的直接原因。     

老年大鼠骨缺损的骨形态发生蛋白-2的基因治疗

目的 通过组织工程和基因工程结合的方法从种子细胞、生长因子、细胞支架三方面满足老年机体骨修复的需要，为这些方法在老年机体的应用提供参考。方法 体外分离、扩增、骨形态发生蛋白-2（BMP2）基因修饰MSCs，检测细胞上清液中BMP2的表达；通过检测成骨细胞标志性蛋白如碱性磷酸酶（ALP）、Ⅰ型胶原（COL Ⅰ-α1）、骨涎蛋白（BSP）、骨桥素（OPN）的表达观察老年大鼠MSCs的成骨分化能力；检测BMP2基因修饰的MSCs与磷酸三钙（TCP）复合物在裸鼠体内的异位成骨能力；将BMP2基因修饰的MSCs／TCP植入老年大鼠骨缺损部位，修复自体股骨6mm节段性骨缺损。结果 BMP2基因修饰的MSCs可以有效分泌BMP2，诱导后第7天有ALP、COLⅠ-α1、OPN、BSP的明显表达，并可诱导裸鼠体内异位成骨。放射学及组织学检测证明BMP2转染的MSCs与TCP载体复合后可成功修复老年大鼠股骨节段性缺损。结论 BMP2基因修饰的老年MSCs可以恢复成骨分化能力，在体内可以成功修复老年大鼠股骨节段性骨缺损，组织工程和基因工程方法可能成为治疗老年性骨骼疾病的新途径。     

转染人骨形态发生蛋白-2基因的羊骨髓间充质干细胞的异位成骨研究

目的评价腺病毒介导的人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)基因转染羊骨髓间充质干细胞(MSCs)后的成骨活性。方法实验分为3组:(1)hBMP-2转染细胞组,(2)半乳糖苷酶基因(βgal)转染细胞组,(3)未转染细胞组。从羊骨髓中分离培养MSCs,基因转染后利用免疫沉淀和Westernblot方法检测BMP-2的表达,并在体外进行碱性磷酸酶(ALP)和VonKossa染色、ALP定量测定、透射电镜观察。分别将细胞悬液注入裸鼠股后部肌内,分期进行X线和组织学检查。结果Westernblot检测发现只有hBMP-2转染细胞组的MSCs表达并分泌hBMP-2。该组于转染后第12d,ALP活性达高峰,与其它两组比较,差异有显著性意义;于16d后出现钙结节,而其它两组未见。透射电镜观察见hBMP-2转染细胞组的细胞内粗面内质网、线粒体和溶酶体增多。裸鼠肌内注射细胞悬液后3周,hBMP-2转染细胞组即有异位成骨,6周时明显增多,其它两组仅见纤维组织形成或微量成骨。结论hBMP-2基因转染能诱导羊MSCs分化为成骨细胞,并在裸鼠体内诱导成骨。     

骨形成蛋白-2基因转染人骨髓间质干细胞诱导异位成骨的实验研究

目的 评价腺病毒介导的人骨形成蛋白—2基因(Adv—hBMP—2)转染人骨髓间质干细胞(MSCs)的诱导成骨能力。方法 从人骨髓中分离培养获取MSCs，分为三组：①Adv—hBMP—2转染细胞组；②Adv—βgal转染细胞组；③未转染细胞组。分别于体外行western immunoblot试验、碱性磷酸酶(ALP)和Von Kossa染色、ALP定量测定，以及裸鼠肌内诱导成骨试验。共9只裸鼠，双例股后肌群内注射，每组6例。结果 Adv—hBMP—2组MSCs可分泌BMP—2蛋白；转染后第9天ALP染色多数细胞为阳性，其它两组ALP染色阳性细胞少见；ALP活性第3天开始升高，12天达高峰为14．76单位，与其它两组比较有统计学意义(P＜0．05)；于第21天后出现钙结节，而其它两组未见。裸鼠肌内注射后4周Adv—hBMP—2组X线片均有异位成骨，Adv—βgal转染细胞组未见明显成骨，未转染细胞组仅有少量骨形成。组织学检查发现：Adv—hBMP—2组也可见典型的板层骨和骨髓腔形成，Adv—βgal组主要为纤维组织，未转染组也可见散在骨小粱形成。结论 Adv—hBMP—2基因转染可诱导人骨髓问质干细胞成骨。     

压缩冲击对骨形成蛋白2基因修饰的组织工程骨的影响

目的观察直接压缩冲击对骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)基因修饰的组织工程骨细胞存活和成骨的影响,以探讨组织工程骨压缩植骨的可行性.方法体外培养扩增犬骨髓基质干细胞(marrow stromal stem cells,MSCs)转染腺病毒介导的人BMP-2(adenovirus mediated human BMP-2,Adv-hBMP-2)基因,与颗粒状的犬异体冻干松质骨复合.复合后4 d进行模拟压缩实验,分别于复合后24 h、4 d,压缩后即刻、1、4 d以扫描电镜观察细胞形态及数量.将单纯冻干骨、未经压缩的Adv-hBMP-2基因修饰的组织工程骨和压缩后4 d的Adv-hBMP 2基因修饰的组织工程骨植入裸鼠背部皮下,于术后6周行组织学观察新骨形成及冻干骨吸收情况.结果复合24 h冻干骨表面细胞展开,部分孔隙可见单层细胞生长;4 d后冻干骨表面细胞复层生长,胶原量多;压缩后即刻,冻干骨与冲击器接触的外表面基本无细胞存在,剖开面可见细胞片状掀起,碎片多;压缩后1 d,冻干骨表面细胞大部分脱落掀起,形成较多的细胞碎片;4 d后细胞数量明显减少,胶原分泌量增多.植入裸鼠背部皮下后,单纯冻干骨新骨形成极少,孔隙内主要为纤维组织,未经压缩的Adv-hBMP-2基因的组织工程骨组可见大量新骨形成,材料中心与周围新骨分布均匀,压缩后的Adv-hBMP-2基因的组织工程骨组新骨量明显减少,且主要在外周.结论体外模拟压缩植骨可明显减少基因修饰的组织工程骨中的细胞存活及体内成骨,但存活细胞的功能仍存在,可适用于压缩植骨重建假体周围骨缺损.