表达SARS冠状病毒受体人ACE2转基因小鼠的建立

目的:建立表达SARS冠状病毒的功能性受体人ACE2的转基因小鼠.方法:克隆人2型血管紧张素转换酶(hACE2)的cDNA,连入PCAGGS构建转基因表达载体,以显微注射的方法将5.6 kb的转基因片段引入小鼠的受精卵.采用PCR、Southern印迹、RT-PCR、Western印迹、免疫荧光染色的方法对转基因小鼠进行鉴定.结果与结论:获得了在小鼠肺组织中表达有SARS病毒功能性受体hACE2的两个转基因小鼠系,证明了SARS病毒的S蛋白能很好地和转基因小鼠肺组织中表达的hACE2受体结合,这将为SARS的研究提供一种良好的感染动物模型.     

5 L生物反应器中长期灌流培养CHO工程细胞生产rt-PA

目的 :利用 5L反应器培养CHO工程细胞生产重组组织型纤溶酶原激活剂 (recombinanttissueplasminogenactivator ,rt PA)。 方法 :在 5L搅拌式生物反应器中采用Cytopore1多孔微载体和无血清培基DF5S连续灌流培养CHO工程细胞株 4B3。结果 :持续培养达 10 3d ,活细胞密度和rt PA生产水平分别达到 6 .52× 10 6 个细胞 /ml和 1716 1U/ml。细胞培养上清经StreamlineSP离子交换层析和Lysine Sepharose 4B亲和层析两步纯化 ,获得纯度达到 98%的rt PA。SDS PAGE分析表明 ,整个培养过程所生产的rt PA具有较好的质量一致性。产品热原检测合格。结论 :实现高密度长期培养 4B3细胞 ,确定 5L培养工艺 ,为进一步扩大生产规模奠定了基础     

小鼠β-酪蛋白基因的克隆及序列分析

目的：从129Sv小鼠基因组文库中分离克隆β－酪蛋白基因。方法：PCR方法扩增部分β－酪蛋白基因作为探针，用原位杂交和PCR方法从小鼠基因组文库中分离克隆β－酪蛋白基因。结果和结论：通过3轮原位杂交分析，获得了包括小鼠β－酪蛋白全长基因在内的阳性克隆，为进一步构建乳腺特异表达基因打靶载体创造了条件。     

反相高效液相色谱法测定重组人干扰素α1b多剂量注射液中间甲酚含量

目的: 建立测定重组人干扰素α1b多剂量注射液中间甲酚含量的高效液相色谱(HPLC)检测方法,并对方法进行验证。方法: 采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法,选用Venusil, ASB-C18(5μm,4.6mm×150mm)色谱柱,流动相为0.2mol.L_^-1硫酸盐缓冲液(pH=2.3)-乙腈(74﹕26),流速1mL.min_^-1,进样量20μL,检测波长270nm,柱温40℃,等度洗脱。对方法进行专属性、线性、准确度、精密度、重复性、检测限、定量限等一系列验证。结果: 该方法在间甲酚含量为100.0～300.0μg.mL_^-1范围内线性良好,r_²值为1.000。相关辅料及干扰素α1b对间甲酚检测无干扰。该方法检测高、中、低3种浓度9组样品回收率(n=9)在96.2%～101.5%;精密度 RSD(n=9)为0.78%;定量下限为4.3mg.mL_^-1,检测下限为1.4mg.mL_^-1。对 6批次重组人干扰素α1b多剂量注射液中间甲酚含量均在其标示量的90～110%之间,质量合格。结论: 建立的RP-HPLC方法专属性良好,精密度、准确性高,可用于检测重组人干扰素α1b多剂量注射液中的间甲酚含量。     

肠道病毒71型病毒样颗粒在汉逊酵母中的表达

目的应用汉逊酵母表达系统进行肠道病毒71型（EV71）病毒样颗粒（VLP）的表达。方法将经过汉逊酵母密码子优化的人EV71的 P1和3CD基因片段克隆到汉逊酵母表达载体PMV上,获得重组表达质粒PMV-P1-3CD,转化汉逊酵母宿主菌AU0501,PCR方法及稳定传代培养筛选整合P1和3 CD基因的重组菌株。重组菌种接种在含有1％甲醇的培养基中进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE、Western blot检测。挑选优胜表达菌株进行30 L发酵罐发酵培养,发酵产物经过粗略纯化后进行电镜分析。结果筛选获得EV71重组表达菌株;SDS-PAGE检测结果显示在相对分子质量（Mr）为26×103、33×103、35×103处有明显的VP3、VP1、VP0蛋白条带,Mr 大小与预期的目的蛋白大小一致;Western blot检测结果显示表达产物与EV71-VP1单克隆抗体在M r 为33×103处有较为明显的VP1反应条带,表达产物具有良好的免疫反应性;表达菌株发酵表达量可达200 mg/L,电镜分析可见24～30 nm的VLP,且颗粒结构完好。结论应用汉逊酵母表达系统成功表达了EV71 VLP,为今后研制EV71 VLP疫苗奠定基础。     

产组织型纤溶酶原激活剂CHO工程细胞无血清培基的研究

在对ＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）进行优化的基础上,以细胞生长和组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）表达为评价指标,筛选无血清培养基添加成分,建立了由优化ＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）,胰岛素,ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－６８维生素Ｃ,乙醇胺和微量元素混合液组成的适于产ｔ－ＰＡＣＨＯ工程细胞４Ｂ３生长和ｔ－ＰＡ表达效果均优于相同条件下用含血清培基培养的效果。     

重组人组织型纤溶酶原激活剂中细胞残余DNA的检测

采用地高辛标记探针,以核酸分子班点杂交技术检测重组人组织型纤溶酶原激活剂（ｒｔ－ＰＡ）中细胞残余ＤＮＡ的方法。从样品中去掉蛋白提取ＤＮＡ的方法能有效的避免蛋白对检测结果的干扰,其灵敏度和结果都能较好地达到ＷＨＯ的要求。