β—内酰胺丝氨酸样蛋白在高脂诱导的心肌细胞损伤中的作用及机制

目的 探讨高脂对心肌细胞的影响及β-内酰胺丝氨酸样蛋白（LACTB）在其中的作用与机制。方法 将小鼠心肌细胞分为正常组（脂肪酸浓度为0μmol/L）和高脂组（HF组,脂肪酸浓度为400μmol/L）,干预18h。采用siRNA敲低心肌细胞LACTB的表达,进一步将HF组分为对照组（仅予以转染试剂处理）、Scra siRNA组（予以转染试剂+非特异阴性siRNA处理）及LACTB siRNA组（予以转染试剂+ LACTB特异性siRNA处理）。为探讨LACTB在高脂诱导的心肌细胞损伤中可能的作用机制,将LACTB siRNA组分为Vehicle组、N-乙酰半胱氨酸（ NAC）组。通过流式细胞仪检测细胞凋亡率,qRT-PCR及Western blot分别检测细胞LACTB mRNA及蛋白表达,DHE染色及ELISA试剂盒检测细胞内活性氧簇（ROS）含量。结果 高脂可增加心肌细胞的凋亡,增加心肌细胞中LACTB的表达,促进ROS生成（均P＜0.05）。与对照组及Scra siRNA组比较,LACTB siRNA组心肌细胞凋亡与ROS生成进一步增加（P＜0.05）;与此相反,在此基础上使用抗氧化剂NAC部分逆转了心肌细胞凋亡（P＜0.05）。结论 LACTB通过抑制氧化应激反应可缓解高脂诱导的小鼠心肌细胞凋亡。     

解偶联蛋白2对高糖高脂高尿酸诱导的心肌细胞凋亡的作用及机制

目的 研究解偶联蛋白2(UCP2)在高糖高脂高尿酸小鼠心肌细胞(MCM)中的作用及机制.方法 以25mmol/L高糖培养基+300μmol/L软脂酸钠干预MCM 18h模拟合并高脂血症的2型糖尿病组(高糖+高脂组),在糖尿病组的基础上再用1500μmol/L尿酸干预18h模拟2型糖尿病合并高尿酸组(高糖+高脂+高尿酸组).随后,采用UCP2抑制剂Genipin抑制心肌线粒体UCP2表达,进一步将2型糖尿病合并高尿酸组分为溶媒对照组、Genipin组.研究UCP2在高糖高脂合并高尿酸心肌细胞损伤的机制时,再分为Genipin组、Genipin+N-乙酰半胱氨酸(NAC)组.采用流式细胞仪检测各组心肌细胞的凋亡水平,q-PCR法和Western blotting检测心肌细胞中UCP2的表达情况,DHE染色及ELISA法检测活性氧簇(ROS)水平.结果 与高糖+高脂组比较,高糖+高脂+高尿酸组心肌细胞凋亡明显增加(P<0.05),心肌细胞中UCP2的表达水平明显降低,同时ROS的水平明显上升(P<0.05).采用Genipin抑制UCP2的表达水平后,高糖高脂高尿酸干预后心肌细胞凋亡水平及ROS水平升高更加明显(P<0.05).在此基础上应用抗氧化剂NAC后,高尿酸所诱导的心肌细胞凋亡及ROS升高被明显逆转(P<0.05).结论 UCP2可以通过抑制氧化应激缓解高糖高脂合并高尿酸所诱导的心肌细胞凋亡.     

槲皮素通过抑制CYP2E1减轻高糖诱导的小鼠心脏微血管内皮细胞损伤的研究

目的:探讨槲皮素(Qu)对高糖诱导的小鼠心脏微血管内皮细胞(CMECs)损伤的影响及细胞色素P450 2E1(CYP2E1)在其中的作用。方法:将CMECs分为正常组(葡萄糖浓度为5.5mmol/L)与高糖组(葡萄糖浓度为30mmol/L)。在高糖基础上,采用异烟肼(Isoniazid)激动CMECs线粒体CYP2E1的表达(Isoniazid组)。为探究Qu减轻高糖诱导CMECs损伤的机制,在高糖组的基础上再给予Qu干预。采用Q-RT-PCR检测CMECs中CYP2E1mRNA的表达水平,Western blot检测CMECs中CYP2E1蛋白的表达水平,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,荧光探针与ELISA试剂盒检测一氧化氮(NO)的生成量,DHE染色与ELISA试剂盒检测细胞内活性氧簇(ROS)水平。结果:高糖增加CYP2E1 mRNA及蛋白表达水平(均P0.05)。Isoniazid加重CMECs损伤,增加ROS生成(均P0.05),N-乙酰半胱氨酸(NAC)则能部分逆转这种趋势(P0.05)。予以Qu干预,CYP2E1mRNA和蛋白的表达水平均显著减少,ROS生成减少,细胞损伤减轻(均P0.05)。结论:Qu通过抑制CYP2E1减轻高糖诱导的CMECs损伤。     

Spartin和白脂素在糖尿病心脏微血管内皮损伤中的作用及其机制探讨

  目的  探讨spartin和白脂素(Asp)在高糖性心脏微血管内皮(CMECs)细胞损伤中的作用及其作用机制。  方法  培养小鼠CMECs,将其分为正常组(葡萄糖浓度为5.5 mmol/L)和高糖组(HG组, 葡萄糖浓度为30 mmol/L),实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及Western blot分别检测CMECs痉挛性截瘫基因20型(spastic paraplegia 20,SPG20) mRNA和spartin蛋白的表达。利用腺病毒(Ad)转染上调spartin表达、小干扰RNA(siRNA)转染下调,采用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)、Asp对下调了spartin表达、并在48 h后用30 mmol/L葡萄糖干预24 h的CMECs进行干预,采用流式细胞学技术检测各组细胞凋亡率,一氧化氮(nitric oxide, NO)荧光探针染色检测NO的生成、超氧化物阴离子荧光探针染色及ELISA试剂盒检测细胞内活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)的生成。建立2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)小鼠模型,分为T2DM组和T2DM+Asp组,模型建立成功后(随机血糖大于16.7 mmol/L)予以Asp(1 μg/g)每天腹腔注射1次,2周后小鼠心脏超声检查心脏舒张功能,心脏微血管腐蚀铸型后扫描电镜观察心脏微血管内皮完整性。  结果  与正常组相比,HG组小鼠CMECs中SPG20 mRNA及spartin蛋白表达均降低(P < 0.05)。在HG培养条件下,Ad感染后CMECs内ROS含量减少(P < 0.05),细胞凋亡水平降低(P < 0.05),NO生成增加;相反,siRNA干预后得到相反的结果。NAC能够部分逆转siRNA的上述作用。Asp能够上调CMECs SPG20 mRNA及spartin蛋白表达,减少ROS的生成,减少细胞凋亡,增加NO的生成,但下调spartin后给予Asp干预,Asp减少ROS生成、减少CMECs凋亡、NO生成增加效应被部分逆转。体内实验发现,Asp可改善2型糖尿病模型小鼠心脏功能和增加心脏微血管内皮的完整性和光滑性。  结论  Asp可通过上调spartin表达途径抑制CMECs内的氧化应激反应,从而减轻糖尿病心脏微血管内皮损伤。     

TRIM8在高糖高脂诱导的小鼠心肌细胞凋亡中的作用

目的:探讨含三基序蛋白8(TRIM8)对高糖高脂(HGHF)诱导的小鼠心肌细胞(MCMs)凋亡的影响及机制。方法:将MCMs分为正常糖(NG)组(葡萄糖浓度为5.5 mmol/L)、高糖(HG)组(葡萄糖浓度为33 mmol/L)、高脂(HF)组(软脂酸钠浓度为300μmol/L)和HGHF组(葡萄糖浓度为33 mmol/L,软脂酸钠浓度为300μmol/L);用siRNA沉默MCMs中TRIM8的表达后,再将MCMs分为对照(control)组(仅给予转染试剂)、Scra-siRNA/PBS组(转染scrambled siRNA)、TRIM8-siRNA/PBS组(转染TRIM8特异性siRNA)、Scra-siRNA/HGHF组和TRIM8-siRNA/HGHF组;为探索TRIM8在HGHF诱导的MCMs损伤中的可能作用机制,将MCMs分为HGHF/DMSO组、HGHF+TRIM8-siRNA+DMSO(HGHF+Ts/DMSO)组、HGHF/ML385组和HGHF+TRIM8-siRNA+ML385(HGHF+Ts/ML385)组。采用流式细胞术检测心肌细胞凋亡率;流式细胞术及DHE染色法检测心肌细胞活性氧簇(ROS)的水平;qPCR及Western blot检测TRIM8、核因子E2相关因子2(Nrf2)、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)、血红素加氧酶1(HO-1)和NAD(P)H:醌氧化还原酶1(NQO-1)的表达水平。结果:HGHF可增加MCMs中TRIM8的表达,同时减少Nrf2及其下游基因GCLC、HO-1和NQO-1的表达(P<0.05)。进一步研究发现,与Scra-siRNA/HGHF组相比,TRIM8-siRNA/HGHF组ROS含量和MCMs凋亡率降低(P<0.05),相应的,抗氧化分子Nrf2及其下游基因GCLC、HO-1和NQO-1的表达增高。与此相反,在此基础上加用Nrf2抑制剂ML385能够部分逆转下调TRIM8对HGHF诱导MCMs凋亡的抑制作用(P<0.05)。结论:TRIM8能够通过调节Nrf2抗氧化途径加剧HGHF诱导的小鼠心肌细胞凋亡。     

白脂素对高糖导致的心肌细胞损伤保护作用的研究

目的检测T2DM小鼠血浆白脂素(Asprosin)浓度变化并探讨其对高糖导致小鼠心肌细胞(MCMs)凋亡的影响和机制。方法40只WT小鼠随机分为糖尿病组(T2DM)和对照组(Con),T2DM组予高脂饮食和STZ腹腔注射造模,Con组予标准饮食喂养,每组20只。检测各组血浆Asprosin浓度;将原代培养的MCMs分为正常血糖组(NG)和高糖组(HG),以不同浓度Asprosin干预24h。选择30nmol/L为后续实验条件,进一步用过氧化氢(H_2O_2)对HG+Asprosin组进行干预。通过流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,用试剂盒检测细胞丙二醛(MDA)和活性氧簇(ROS)含量。结果与Con组比较,T2DM组血浆Asprosin浓度升高[(17.67±0.89)vs(11.95±0.70)nmol/L,P0.05];Asprosin能降低高糖诱导的MCMs凋亡[(26.73±0.73)%vs(20.99±1.04)%,P0.05],并抑制MDA和ROS生成,而H_2O_2能逆转上述现象(P0.05)。结论 T2DM状态血浆中Asprosin浓度增高,能抑制氧化应激介导的MCMs凋亡,可能是糖尿病心肌病的一种自我保护机制。