QIAGEN质粒DNA纯化柱的再生利用

1　材料和方法1.1　材料　 QIAGEN Plasmid Maxi kit (QIAGEN- tip 5 0 0 ) ,纯化专用试剂 (P1,P2 ,P3,QBT,QC,QF,具体配方见 QI-AGEN质粒纯化手册 ) . pc DNA3.1(- ) /MSP1 - 1 9为将 PCR扩增的恶性疟原虫裂殖子表面蛋白 1(MSP1)的 17区基因片段(30 0 bp)以 Eco RI和 Bam HI酶切位点克隆入 pc DNA3.1(- )中 [2 ] ,pc DNA3.1(- )为 Introgen公司的真核表达质粒 .在研究 pc DNA3.1(- ) /MSP1 - 1 9作为 DNA疫苗效果时 ,需大量纯化该质粒 ,故本研究在纯化该质粒的同时 ,同样用该质粒进行纯化柱再生研究 .菌株为大肠…     

细胞因子表达质粒对恶性疟原虫顶端膜抗原1DNA免疫的调节作用

目的　探讨细胞因子表达质粒对小鼠DNA免疫的促进和调节作用。　方法　构建编码恶性疟原虫顶端膜抗原1(AMA1)完整胞外域的DNA免疫质粒VR1020/E,构建编码小鼠细胞因子(GMCSF)、白细胞介素(IL)如IL4和IL12的真核表达质粒pcDNA3/GMCSF、pcDNA3.1( ) /IL4和pIL12以及双顺反子质粒pGM CSF/pTPA E,分组免疫小鼠,ELISA检测血清中特异性IgG及其亚类的水平,取小鼠脾细胞进行体外增殖。　结果　 3种细胞因子质粒均有效增强了小鼠针对VR10 20/E的免疫应答,抗体水平增加7至10倍,其中pcDNA3/GMCSF质粒和pIL12质粒分别显著促进了小鼠的IgG1和IgG2a应答,小鼠脾细胞的体外增殖水平亦有明显提高。　结论　利用编码GM CSF、IL4和IL12的表达质粒作为佐剂可有效增强小鼠针对AMA1DNA的免疫应答,并对免疫应答的类型产生调节作用。     

婴儿利什曼原虫酶群MON-1的遗传异质性和种系发生情况

尽管婴儿利什曼原虫酶群(所有具有相同同工酶酶谱的总和)MON-1可引起皮肤型利什曼病,但在地中海盆地是内脏利什曼病的主要病因。MON-1分类是基于淀粉多位点酶电泳(MLEE)分型。本研究旨在利用两种不同分型技术对该酶群的遗传多态性和种系情况进行分析,即MLEE和随机扩增多态DNA(RAPD)。     

插入四环素操纵子对恶性疟原虫血型糖蛋白结合蛋白130基因启动子活性的影响

目的　构建四环素操纵子 (TetO)修饰的恶性疟原虫血型糖蛋白结合蛋白 13 0基因 (GBP13 0 )启动子 ,并探讨TetO插入后对启动子活性影响的位置效应。　方法　将 7个拷贝的TetO ( 7cot)序列分别克隆入GBP13 0启动子转录起始点附近的 4个位点 ,上、下游各两个 ,产生 4个衍生质粒pG/ 7T( -5 ) ,pG/ 7T( -2 ) ,pG/ 7T( +2 )和pG/ 7T( +5 )。瞬时转染后通过CATELISA检测和分析pGBPCATΔ2和 4个衍生质粒中CAT报告基因的表达水平。　结果　限制性酶切、PCR扩增和DNA测序证明质粒构建成功。转染和CAT检测表明 ,7cot插入到GBP13 0启动子的 4个位点中均可提高启动子的活性 ,并且定位于启动子下游比定位于上游具有更高的活性 ,其中于 +5位点启动子活性最高。　结论　在疟原虫四环素诱导性转基因表达系统中质粒pG/ 7T( +5 )可作为反应质粒加以应用。     

恶性疟原虫GBP130基因5′近端侧翼序列调控功能的研究

目的　对GBP130的 5′近端侧翼序列进行分析 ,发现可能的强度和期特异性调控元件。　方法　构建含有不同长度GBP130启动子的质粒载体。用pGBPCATΔ 2、pGBPΔ2 /4 0 0和 pGBPΔ2 /80 0分别转染疟原虫 ,在转染后 48h收集虫体制备细胞抽提物 ,检测报告分子CAT活性 ,分析近端侧翼序列不同区域的强度调控功能。另将 pGBPΔ2 /4 0 0和pGBPΔ2 /80 0分别同时转染疟原虫 ,分别于转染后 5h、15h和 46h收集虫体 ,制备细胞抽提物 ,检测CAT活性 ,分析近端侧翼序列不同区域的期特异性调控功能。　结果　强度分析中 ,当从转录起始点下游删除较小的片段 ( pGBPΔ2 /80 0 ) ,CAT表达水平与pGBPCATΔ 2中CAT水平无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ,当删除近端较大片段 ( pGBPΔ2 /4 0 0 )时 ,CAT表达水平明显下降 (P <0 .0 5 )。同时 pGBPΔ2 /4 0 0的转录活性与对照组也有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;期特异性分析 ,pGBPΔ2 /4 0 0与pGBPΔ2 /80 0相比 ,在 5h时前者转录活性高于后者 ,但在 15h和 46h时 ,后者转录活性高于前者 ,提示 2种质粒在疟原虫不同生活阶段具有期特异性调控。　结论　推测不同GBP130启动子活性强度的差异是因为 5′UTR长度的不同 ,较长的UTR可促进基因的转录表达 ,可能GBP130基因近端侧翼序列中 2个同聚 po     

枸橼酸钠抗凝剂对疟原虫生长活性的影响

目的　了解枸橼酸钠抗凝剂对疟原虫生长活性的影响。　方法　将疟原虫经抗凝剂(ACD,CD和SC)处理后以感染率为指标检测抗凝剂对虫体的影响。未同步化的恶性疟原虫分别使用3种不同浓度抗凝剂于37℃作用3h。处理后的红细胞与正常虫体混合,同时处理后的虫体与正常红细胞混合,随后观察两种培养混合物的感染率以确定抗凝剂作用的靶细胞。同上处理期同步化的疟原虫(环状体,滋养体和裂殖体)以观察抗凝剂作用的期特异性。将伯氏疟原虫用抗凝剂处理后接种小鼠,通过感染率的变化观察抗凝剂对鼠疟的影响。　结果　 3种抗凝剂均可抑制疟原虫的生长,其中ACD影响最甚。以抗凝剂分别处理红细胞和疟原虫,结果表明抗凝剂作用于虫体而非红细胞。处理同步化的虫体表明抗凝剂对裂殖体的抑制最为显著。同样处理伯氏疟原虫后接种小鼠进一步验证了抗凝剂对恶性疟原虫作用的抑制性效应。　结论　ACD对疟原虫的抑制性效应最为明显,SC是疟原虫试验中枸橼酸钠抗凝剂的首选。     

人抵抗素基因全长的体外拼接及真核表达载体的构建

目的:利用合成的寡核苷酸片段,在体外拼接人抵抗素(Resistin,Retn)基因的全长,并构建其真核表达载体。方法:根据已知抵抗素基因(GenBank:AF323081),设计并合成10条寡核苷酸片段,采用降落PCR方法进行拼接,获得预期大小的PCR产物后将其克隆入pSecTag2B载体进行测序确认。结果:降落PCR法扩增的特异条带与目的基因的大小一致。克隆载体测序结果与GenBank中已知序列完全符合。结论:降落PCR成功地拼接和扩增了人抵抗素全长基因,并构建了含有该基因的真核表达载体,为进一步研究该基因的功能奠定了实验基础。     

单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白B胞浆区编码基因的原核表达、纯化及抗体制备

目的 获得高纯度的重组单纯疱疹病毒I型（HSV－1）糖蛋白B（gB）胞浆区蛋白并制备其特异性抗体。方法 从感染HSV－1的BHK细胞中,提取总RNA,用RT－PCR特异性扩增HSV－1gB胞浆区编码基因,经双酶切后,克隆人表达载体pGEX4T－1中,进行融合表达。以纯化的重组蛋白免疫小鼠制备抗体,进行Westernblot鉴定。结果 用IPTG诱导后,表达出相对分子质量（Mt）约42000的融合蛋白。用纯化的融合蛋白免疫小鼠制备的抗体滴度为1：400。结论 获得重组HSV－1gB胞浆区蛋白及其特异性抗体,为后续功能研究奠定了基础。     

恶性疟原虫富组氨酸蛋白-2基因诱导的免疫应答研究

[目的 ]探讨编码恶性疟原虫富组氨酸蛋白 2 (HRP Ⅱ )C端基因的真核表达重组质粒诱导小鼠的体液和细胞免疫效果。 [方法 ]将起始码和终止码引入HRP ⅡC端基因片段两端 ,经测序鉴定读框 ,将包含起始码和终止码的HRP Ⅱ基因片段克隆入真核表达质粒pcDNA3 1( )中 ,进行酶切鉴定。用重组真核表达质粒pcDNA3 1( ) /HRP Ⅱ 经肌肉免疫小鼠 3次 ,每次间隔 3wk。第 3次免疫后 2wk ,取小鼠血清和脾细胞 ,分别用ELISA测定HRP Ⅱ抗体水平和用脾细胞增殖实验测定细胞免疫反应。 [结果 ]序列测定结果表明 ,HRP ⅡC端基因片段被准确地引入起始码和终止码 ;酶切鉴定表明包含起始码和终止码的HRP ⅡC端基因片段成功地克隆入pcDNA3 1( ) ,形成pcDNA3 1( ) /HRP Ⅱ 。在pcDNA3 1( ) /HRP Ⅱ 免疫鼠血清中可检测出高水平的HRP Ⅱ抗体 ,用原核表达的HRP Ⅱ蛋白刺激免疫脾细胞 ,可检测出明显的细胞增殖反应。 [结论 ]编码HRP Ⅱ的真核表达重组质粒可诱导小鼠产生明显的体液和细胞免疫反应。其有可能作为恶性疟原虫红内期复合DNA疫苗的候选基因