结核分枝杆菌Rv3425蛋白原核可溶性表达

目的在原核系统内获得结核分枝杆菌Rv3425蛋白可溶性表达并进行纯化,Western-blot技术初步鉴定重组蛋白的抗原性和特异性。方法将Rv3425核酸编码序列克隆至融合表达载体p ET-Dsb C中,然后进行融合蛋白Dsb CRv3425表达并实现亲和纯化,用Western-blot分析其抗原性和特异性。结果 Rv3425基因在大肠杆菌中获得可溶性表达,亲和纯化的Dsb C-Rv3425蛋白与结核病患者血清标本呈强阳性反应,与健康人血清标本呈阴性反应。结论Dsb C-Rv3425蛋白在大肠杆菌中以可溶性表达形式存在,具有较好的抗原特异性和免疫原性,对结核病诊断有潜在的应用价值。     

PBMCs结核分枝杆菌特异性抗原反应性MIG和IFN-γ对活动期肺结核的鉴别诊断意义

目的研究活动期肺结核和常见肺部鉴别诊断疾病肺炎及原发性肺癌患者的外周血单个核细胞（PBMCs）经结核分枝杆菌特异性抗原肽刺激后干扰素-γ诱导的单核因子（Monokine induced by interferon gamma,MIG）和干扰素-γ（IFN-1）的表达特点及诊断意义。方法90例初治活动期肺结核患者,31例细菌性肺炎和原发性支气管肺癌患者,分离外周血PBMCs,用结核分枝杆菌特异性抗原肽刺激,采用Flowcytomix流式技术检测细胞培养液上清上中MIG和IFN-γ的表达。用接受者工作特征曲线（ROCcurve）评价结核分枝杆菌特异性抗原反应性MIG和IFN-γ的诊断价值。结果PBMCs经结核分枝杆菌特异性抗原肽刺激后,培养液上清中MIG水平显著升高,初治活动期肺结核患者与其他肺病对照组差异有统计学意义（3023．0pg／mlvs112．5pg／ml,P〈0．0001）,与IFN-γ的表达水平呈正相关（r=0．7168,P〈0．0001）,单独应用MIG诊断肺结核的敏感性为94．4％,单独应用IFN-γ诊断肺结核的特异性为96．8％,二者并联应用诊断肺结核的敏感性为97．8％,特异性为87．1％。结论结核分枝杆菌特异性抗原肽刺激外周血单个核细胞产生的MIG和IFN-γ能够良好的鉴别初治活动期肺结核及常见的细菌性肺炎和原发性支气管肺癌,可能成为新的诊断指标。     

CD244 与活动性肺结核患者CD56bright NK 细胞表型及功能的关系研究

目的:探索CD244 与活动性肺结核患者CD56brightNK 细胞表型及功能的关系。方法:用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMCs),用流式细胞术检测活动性肺结核患者与正常对照者CD56brightNK 细胞表面CD244、CD94、NKG2D表达差异,进一步检测活动性肺结核患者CD56bright NK 细胞CD244 与Tim3、CD27、CD62L、CCR7、CD107a、IFN-β表达的关系。结果:不经过结核菌抗原刺激的外周血中的CD56brightNK 细胞表面CD244 表达在活动性肺结核患者和正常对照中并没有显著性差异;经过结核菌抗原刺激的活动性肺结核患者CD56bright NK 细胞表面CD244 表达显著高于正常对者;CD56bright NK 细胞表面CD94 和NKG2D 表达,在活动性肺结核患者与健康对照者之间无显著性差异;活动性肺结核患者CD244+ CD56bright NK 细胞表面Tim3+细胞显著性升高,而细胞表面CD62L 显著性降低,细胞内IFN鄄酌显著性降低;然而CD244+ CD56bright NK 细胞和CD244- CD56brightNK 细胞之间CD107a 表达无显著性差异。结论:在活动性肺结核患者PBMCs 中CD56brightNK 细胞表面高表达CD244,可能与抑制受体Tim3 协同抑制IFN-β的表达,但是与NK 细胞的脱颗粒作用无关。     

结核性胸膜炎患者MAIT细胞IFN-γ免疫应答特征及其与疾病转归的相关性

目的研究结核性胸膜炎患者胸腔积液中MAIT细胞IFN-γ免疫应答特征及其与疾病转归的相关性。方法提取61份结核性胸腔积液PFMCs,用结核分枝杆菌H37Rv裂解液刺激后收集细胞,进行流式抗体染色。另外有17例患者重复收集胸水,10例治疗效果好,胸水吸收,另7例无明显治疗效果,比较其治疗前后IFN-γ~+ MAIT细胞比例。结果结核分枝杆菌抗原刺激后,结核性胸膜炎患者胸腔积液CD8~+T细胞亚群中MAIT细胞对结核抗原应答生成的IFN-γ比例为(30.49±3.23)%。男女性别和不同年龄患者的IFN-γ~+ MAIT细胞比例均无显著差异。痰涂片/培养阳性和阴性患者的IFN-γ~+ MAIT细胞比例分别为(53.44±5.48)%和(33.98±2.45)%,差异有统计学意义(P=0.0027)。治疗效果好的患者治疗后IFN-γ~+ MAIT细胞比例明显上升,治疗前后比例分别为(34.3±3.69)%和(49.9±3.79)%,差异有统计学意义(P=0.0003)。治疗效果不好的患者IFN-γ~+ MAIT细胞比例也有所上升,但差异没有统计学意义。结论 MAIT细胞通过生成细胞因子IFN-γ而在局部抗结核免疫中发挥重要作用。     

CD244促进活动性肺结核患者抗原特异性CD8~+T细胞的细胞毒作用

目的研究表面受体CD244在活动性肺结核患者抗原特异性CD8+T细胞中的功能。方法密度梯度离心法提取活动性肺结核患者和ELISPOT阳性潜伏感染者的外周血单个核细胞,用ESAT-6和CFP-10多肽刺激PBMCs,然后用CD69标记抗原特异性细胞,通过流式细胞术检测CD244在CD3+CD8+CD69+细胞中的表达;流式细胞术分析CD244与脱颗粒相关的CD107a表达的关系;通过细胞内染色方法检测CD244与穿孔素和颗粒酶B的关系。结果 CD244在活动性肺结核患者的CD8+T细胞表达显著高于潜伏感染者(P=0.000 5);在抗原特异性CD8+T细胞,CD244+细胞表达CD107a比例显著高于CD244-细胞(P=0.002 2);CD244+细胞表达穿孔素和颗粒酶B比例显著高于CD244-细胞(P值分别为0.021 2,0.002 3)。结论 CD244促进活动性肺结核患者的抗原特异性CD8+T细胞的细胞毒作用。     

结核分枝杆菌Rv2608抗原的多肽预测及实验验证

【摘要】目的寻找结核分枝杆菌抗原Rv2608的T细胞反应多肽,以用于结核病治疗或辅助治疗。方法采用生物信息学方法预测Rv2608的T细胞表位,筛选表位集中、亲和力较强、理化性质稳定的长链多肽,进行化学合成,应用酶联免疫斑点技术检测多肽刺激活动性结核病患者免疫细胞分泌IFN-γ的能力。结果预测并筛选出Rv2608长链多肽4条,ELISPOT结果表明4条多肽可以激活部分活动性结核病患者的免疫细胞,其中Rv2608p3的免疫激活效率最高。结论软件预测与初步鉴定结果具有一致性,Rv2608p3可用于结核病治疗性疫苗的进一步研究。     

肺结核患者外周血CD4+T细胞穿孔素表达下降

目的研究活动性肺结核患者外周血单个核细胞(PBMCs)穿孔素(Perforin)的表达及临床意义。方法采集19例活动期肺结核患者和23位健康对照外周血,纯化PBMCs,用结核分枝杆菌ESAT-6和CFP-10混合性抗原肽库刺激,通过细胞表面标记和细胞内细胞因子染色技术,采用流式技术检测CD4+、CD8+T细胞穿孔素的表达。结果与对照组比较,肺结核患者PBMCs中的CD4+T、CD8+T细胞亚群分布无显著性差异,但肺结核患者PBMCs及CD4+T细胞中穿孔素的表达比例(百分率)下降(PBMCs:肺结核组19.55%±2.53%,对照组27.53%±1.90%,P<0.05;CD4+T细胞:肺结核组4.42%±0.84%,对照组8.15%±1.29%,P<0.05),而PBMCs及CD4+、CD8+T细胞中穿孔素的表达量无显著性差异。结论活动期初治肺结核CD4+T细胞群内Perforin的表达比例下降可能会使CD4+T细胞对靶细胞的细胞毒性作用(CTL)下降。     

γ 干扰素释放试验诊断实体器官移植术前患者潜伏结核感染的Meta分析

目的：以结核菌素试验为参考标准,系统评价γ干扰素释放试验在诊断实体器官移植术前患者潜伏结核感染的临床价值。方法计算机检索 PubMed、EMBASE、Cochrane 图书馆,检索时间为建库至2012年8月,全面收集γ干扰素释放试验诊断实体器官移植术前患者潜伏结核感染的研究。用Meta Disc 1．4软件对其合并的特异度、敏感度、阴性似然比、阳性似然比等进行分析,绘制综合受试者工作特征曲线。结果最终纳入6个包括QFT-IT试验和T-SPOT试验的γ干扰素释放试验的研究。 QFT-IT试验和T-SPOT 试验对实体器官移植术前患者潜伏结核感染的诊断价值的合并特异度、合并敏感度、合并阳性似然比、合并阴性似然比、合并诊断比值比及综合受试者工作特征曲线下面积分别为81％、74％、3．94、0．33、12．44、0．8478和78％、75％、3．61、0．32、12．07、0．8450。结论经综合受试者工作特征曲线证实,γ干扰素释放试验在实体器官移植术前患者潜伏结核感染诊断中,不适用于结核感染的筛查,也不适合进一步鉴别诊断移植术前患者是否处于潜伏结核,上述结果尚需更多科学的、设计严谨的临床试验进一步证实。     

肺结核患者外周血单个核细胞MCP-1表达上升

目的 研究肺结核患者血浆单核细胞趋化蛋白（MCP-1）的浓度特点及外周血单核细胞（PBMCs）经结核分枝杆菌特异性抗原肽刺激后MCP-1和IFN-γ的表达及相关性.方法 20例活动期肺结核患者和16位PPD阳性健康对照,采集EDTA抗凝血,用结核分枝杆菌特异性抗原肽刺激PBMCs,采用FlowCytomix流式技术检测血浆和细胞培养液上清上中MCP-1和IFN-γ的表达.结果 肺结核患者血浆MCP-1浓度与对照组比较差异无统计学意义[肺结核组（263.8±25.31）pg/ml,对照组（212.1±18.04）pg/ml,P＞0.05],但肺结核患者的血浆MCP-1水平偏高,尤其是呼吸道症状明显的患者.肺结核患者的PBMCs经结核分枝杆菌特异性抗原肽刺激后,培养液上清中MCP-1的水平比血浆显著升高,肺结核患者与对照组比较差异有统计学意义[（21460±3376）pg/ml vs 10910±2141）pg/ml,P＜0.01],与IFN-γ的分泌无关（spearman r=0.1835,P＞0.05）.结论 肺结核患者血浆MCP-1浓度可能与病情发展相关;结核分枝杆菌特异性抗原肽刺激外周血单个核细胞产生的MCP-1可能成为新的诊断指标之一.     

人巨细胞病毒pp150-gp52蛋白原核可溶性表达与IgM捕获ELISA方法建立和应用

目的原核系统内表达并纯化巨细胞病毒pp150-gp52融合蛋白优势抗原表位,建立IgM捕获ELISA方法并应用。方法通过重叠PCR技术扩增获得巨细胞病毒pp150-gp52优势片段核酸序列,在原核系统内可溶性表达DsbC-pp150-gp52融合蛋白并纯化,用Western blot和ELISA检测融合蛋白的特异性和应用价值。结果纯化获得的融合蛋白DsbC-pp150-gp52经酶标记建立IgM捕获ELISA方法,检测60份临床阳性血清和60份健康人血清。其中以酶标记DsbC-pp150-gp52蛋白建立的捕获ELISA法阳性检出率96.7% ,阴性检出率100%,初步验证DsbC-pp150-gp52融合肽具有非常好的抗原特异性。结论融合蛋白DsbC-pp150-gp52在大肠埃希菌中以可溶性表达形式存在,获得的高纯度重组融合蛋白具有抗原性和特异性强的特点,采用IgM捕获ELISA的实验方法,可开发检测试剂盒用于风疹病毒的早期检测。