局灶性脑缺血后老年大鼠室管膜下区和颗粒下层细胞增殖与分化的实验研究

目的观察老年大鼠局灶性脑缺血后室管膜下区（SVZ）和颗粒下层（SGZ）神经干细胞的增殖与分化.方法取老年大鼠制作大脑中动脉梗塞模型.用5-溴脱氧尿核苷（BrdU）脉冲标记结合免疫组织化学单标记技术,观察正常组、假手术组、脑缺血后3、7、14、21、28 d组SVZ和SGZ区BrdU阳性细胞的变化;用BrdU累积标记结合免疫组织化学双标技术,观察脑缺血14 d后SVZ和SGZ区BrdU/NeuN和BrdU/GFAP双标阳性细胞的数量.结果在正常组、假手术组及各脑缺血组大鼠的双侧SVZ和SGZ均可观察到BrdU阳性细胞.与正常组和假手术组相比,脑缺血后SVZ和SGZ区BrdU阳性细胞明显增加.缺血组SVZ区BrdU阳性细胞在脑缺血后7 d时达到高峰,28 d时仍高于正常水平;SGZ区BrdU阳性细胞在脑缺血后14 d时达到高峰,28 d时仍高于正常水平.通过BrdU累积标记和免疫组织化学双标发现：脑缺血14 d后,老年大鼠SVZ区有部分细胞显示BrdU/NeuN（0.98%）或BrdU/GFAP（12.56%）双标阳性,而SGZ区未见双标细胞.结论局灶性脑缺血可激活老年大鼠室管膜下区和颗粒下层的神经干细胞明显增殖,并且室管膜下区有部分增殖细胞可分化为神经元或神经胶质.     

局灶性脑缺血大鼠皮质和尾壳核神经干细胞增殖分化与nNOS的表达

本研究旨在探讨局灶性脑缺血再灌注大鼠皮质和尾壳核神经干细胞的增殖分化与nNOS表达的关系。大脑中动脉线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,5溴脱氧尿核苷(BrdU)标记分裂增殖细胞,免疫组化单标和双标记技术检测各组大鼠缺血侧皮质和尾壳核BrdU阳性细胞和nNOS的表达。模型组大鼠皮质和尾壳核BrdU阳性细胞再灌注后3d开始增多,14d达高峰,nNOS阳性细胞再灌注后7d表达增强,28d达高峰,BrdU/nNOS双标细胞在14d达高峰,占皮质BrdU阳性细胞数的42.95%,尾壳核内占42.56%。新生细胞分化组BrdU阳性细胞和BrdU/nNOS双标细胞显著多于模型组(P<0.05),皮质双标细胞占BrdU阳性细胞数的54.08%,尾壳核内占47.84%。提示局灶性脑缺血可增强大鼠皮质和尾壳核的增殖能力,部分增殖细胞分化为nNOS阳性神经元,参与神经网络的重建。     

高血压脑出血致张力性血肿的临床观察

高血压脑出血致张力性血肿为一种特殊类型的颅内血肿,南于具有扩展性,占位效应明显,极易误诊为高血压脑出血后继发性脑水肿或中枢神经系统肿瘤而延误治疗时机,病死率和病残率较高.目前,囡内关于高血压脑出血敛张力性血肿的文献报道较少,我院自1997年1月-2007年11月共治疗36例高血压脑出血致张力性血肿患者,现对其临床特点和治疗原则进行回顾性分析.     

p38 MAPK在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中的作用

目的探讨p38 MAPK在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用及可能机制。方法雄性SD大鼠随机分为5组:空白对照组、假手术组、缺血再灌注组、给药组及溶媒组。除对照组及假手术组外各组采用线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型。给药组和溶媒组分别侧脑室注射p38 MAPK特异性抑制剂SB202190及1%DMSO。每组分别进行行为学评分和检测Bcl-2、Bax表达的变化。结果①行为学结果:空白对照组及假手术组,缺血再灌注后24 h大鼠神经功能评分降低,给药组大鼠神经功能评分高于缺血再灌注组,有统计学差异(P<0.01)。②免疫印迹检测结果:空白对照组及假手术组可见少量Bcl-2、Bax蛋白表达,两组间无统计学差异(P>0.05);缺血再灌注组再灌注后24 h可见Bcl-2表达减少,但与空白对照组及假手术组相比无统计学差异(P>0.05),而再灌注后24 h可见Bax蛋白表达明显增加,与空白对照组及假手术组相比有统计学差异(P<0.05);给药组与缺血再灌注组相比再灌注后24 h可见Bax蛋白表达明显减少(P<0.05),而Bcl-2蛋白表达明显增加(P<0.05)。结论抑制p38 MAPK激活可以减轻大鼠脑缺血再灌注时的脑神经元的凋亡。     

成年和老年大鼠局灶性脑缺血后脑室下区细胞的增殖分化

目的：比较老年和成年大鼠局灶性脑缺血后脑室下区（SVZ）神经干细胞的增殖与分化。方法：制作大脑中动脉梗死模型,用免疫组化法检测SVZ的5-溴脱氧尿核苷（BrdU）、神经元核抗原（NeuN）及胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性细胞数的变化。结果：SVZ的BrdU阳性细胞在正常组和假手术组成年大鼠明显多于老年大鼠。实验组成年和老年大鼠均在缺血后增加,28d时仍高于正常水平,但成年大鼠各时间点均明显高于老年大鼠。在新生细胞中部分细胞是Brdu／NeuN或BrdU／GFAP双标细胞,但老年大鼠Brdu／NeuN双标细胞明显少于成年大鼠。结论：大鼠脑缺血激活SVZ神经干细胞增殖能力,成年大鼠明显强于老年大鼠,且新生细胞分化为神经元的比例也明显高于老年大鼠。     

大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤时SB202190的保护作用

目的:研究SB202190对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的影响,探讨SB202190在脑缺血保护中的作用及可能机制.方法:采用线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型.雄性SD大鼠.随机分成5组:空白对照组、假手术组、缺血再灌注组、给药组及溶媒组.每组6只大鼠,给药组及溶媒组分别侧脑室注射p38MAPK特异性抑制剂SB202190及1%DMSO.各组分别进行大鼠神经功能的行为学评分:Nissl染色观察缺血区细胞形态变化;免疫组化检测Bcl-2、Bax阳性神经元变化.结果:缺血再灌注后24 h大鼠神经功能评分显著低于假手术组,有统计学差异(P<0.05),给药组大鼠神经功能评分显著高于缺血再灌注组,有统计学差异(P<0.05).而溶媒组神经功能评分与缺血再灌注组相比无统计学关差异(P>0.05).再灌注后24 h镜下可见大部分细胞萎缩,胞浆减少,胞核浓染,细胞间隙增大.给药组与缺血再灌注组相比再灌注后24 h细胞形态较好,坏死程度较轻.免疫组化检测结果:空白对照绀及假手术组可见极少数Bcl-2、Bax阳性细胞散在分布,两组间无统计学差异(P>0.05);再灌注后24 h可见大量Bax阳性细胞,与假手术组相比有统计学差异(P<0.05),而Bcl-2阳性细胞无明显变化(P>0.05);与缺血再灌注组比较给药组再灌注后24 h Bax阳性细胞明显减少.有统计学差异(P<0.05),Bcl-2阳性细胞与缺血再灌注组比较明显增多,有统计学差异(P<0.05).结论:p38MAPK特异性抑制剂SB202190可以改善大鼠局灶性脑缺血冉灌注后产生的神经功能缺损症状及神经细胞形态学改变:SB202190能改变局灶性脑缺血再灌注后Bcl-2及Bax的表达,这可能是SB202190抗细胞凋亡的机制之一.     

局灶性脑缺血大鼠学习记忆能力与海马齿状回nNOS表达的关系

目的观察局灶性脑缺血再灌注大鼠学习记忆与海马齿状回神经元型一氧化氮合酶（nNOS）表达的关系。方法大脑中动脉线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，5-溴脱氧尿核苷（Brdu）标记分裂增殖细胞，应用Y型电迷宫监测大鼠学习记忆能力，免疫组化单标和双标技术检测大鼠海马齿状回BrdU阳性细胞数和nNOS的表达。结果局灶性脑缺血再灌注对学习记忆能力损害明显，但随着再灌注时问的延长学习记忆能力有较好恢复，再灌注28d恢复明显。海马齿状回Brdu阳性细胞增加，14d达高峰；再灌注后7d nNOS表达增强，28d达高峰，BrdU／nNOS双标细胞在14d达高峰。结论局灶性脑缺血再灌注可增强大鼠海马齿状回细胞的增殖能力，增殖细胞nNOS的表达对大鼠学习记忆能力恢复有促进作用。     

胚胎大鼠大脑额叶皮质神经干细胞的分离、培养与鉴定

目的：探讨从胚胎大鼠大脑额叶皮质分离培养神经干细胞（neural stem cell，NSCs）的方法及NSC。的特性。方法：将14．5d胎龄的大鼠额叶皮质脑组织制备成单细胞悬液，于含EGF和bFGF的DMEM／F12无血清培养液中培养，形成原代细胞球后，进行单细胞克隆传代扩增。免疫荧光组化方法检测克隆球Nestin、Map-2、GFAP抗体标记情况。结果：原代培养2周后，可形成大量悬浮生长的神经球，BrdU和Nestin检测呈阳性，诱导分化后呈Map-2、GFAP阳性。结论：可从胚鼠脑皮质中分离培养纯化、扩增传代获得NSCs，经诱导后可以分化为神经元和星形胶质细胞，可作为细胞替代治疗中枢神经系统疾病的供体来源。     

GDNF对局灶性脑缺血MRI及皮质和尾壳核神经干细胞增殖和分化的影响

观察胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对大鼠局灶性脑缺血磁共振成像(MRI)及皮质和尾壳核神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响,并探讨GDNF对内源性NSCs增殖分化的作用机制。制作右侧局灶性脑缺血模型,左侧脑室注射GDNF,5-溴脱氧尿核苷(BrdU)标记DNA合成期(S期)细胞,Y迷宫检测大鼠学习记忆能力,MRI观察脑部影像学变化,免疫组化法观察正常组、假手术组、缺血组、生理盐水组和GDNF组大鼠局灶性脑缺血90min后再灌注不同时间(3、7、14、21、28d)皮质和尾壳核内BrdU/nestin、BrdU/NeuN、BrdU/GFAP阳性双标细胞。GDNF组对学习记忆的恢复较模型组和生理盐水组明显;MRI检查T2WI上缺血区信号明显增高和轻微脑肿胀,GDNF组缺血后3d,缺血区出现小面积信号增高影,14d信号强度明显下降;GDNF组Br-dU/nestin双标细胞数明显增加;新生细胞分化结果显示28d时,GDNF组BrdU/NeuN(58.23%±15.30%)、BrdU/GFAP(11.29%±4.30%),与其它组相比均有显著性差异(P<0.05)。以上结果证实局灶性脑缺血激活皮质和尾壳核内的NSCs,而GDNF可促进内源性NSCs增殖、分化,从而促进学习记忆能力的恢复。     

2型腺相关病毒重组绿色荧光蛋白对培养神经干细胞转染效率的研究

为探讨2型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus2,rAAV-2)载体能否有效地转染神经干细胞(neural stem cell,NSC),本研究采用含有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因的rAAV-2(rAAV-2/EGFP),以感染复数(multiplicity of infection,MOI)分别为1×104、1×105、1×106转染体外培养大鼠胎鼠神经干细胞,在荧光显微镜下观察EGFP的表达。同时,检测子代细胞的活力、增殖倍数、分化情况,以评估rAAV-2对NSC存活、增殖、分化能力的影响。并利用流式细胞仪检测rAAV-2/EGFP对NSC的转染效率。结果显示,转染10d后各转染组可观察到NSC克隆球发出绿色荧光,起始荧光强度不一,同时荧光强度随时间的延长而逐渐增强。转染21d后荧光强度达高峰并维持在高水平。流式细胞仪检测结果表明:MOI为1×104、1×105、1×106时转染率分别为26.34%、50.97%、56.36%,荧光指数(FI)分别为4.01、12.70、14.08。转染组和未转染组细胞培养7、14、21d时其细胞活力、增殖倍数、分化均无统计学差异。本实验初步证明rAAV-2能有效地转染NSC。