类泛素蛋白FAT10与肝细胞癌

泛素/类泛素系统是体内细胞蛋白降解的一个重要途径,大量研究表明该系统功能失调将导致癌基因和抑癌基因表达的异常,在肿瘤的发生发展中起重要作用.FAT10是近年发现的类泛素蛋白家族成员,FAT10在肝细胞癌等恶性肿瘤中表达水平异常增高,很有可能成为一个新的肝细胞癌形成前标记物.     

腹腔镜辅助下与开腹部分肝脏切除的对比分析

目的探讨利用腹腔镜的辅助完成部分肝脏切除手术和单纯开腹手术切除部分肝脏的优劣。方法腹腔镜辅助下肝段切除手术病例15例（腹腔镜辅助组）和单纯开腹手术切除部分肝脏病例21例（单纯性开腹组），比较2组的手术时间、出血量、切口长度、住院时间和并发症等情况。结果2组手术时间、出血量比较差异无统计学意义（P〉0.05）；腹腔镜辅助组切口长度、住院时间分别为（7．57±1．30）cm、（8．67±2．02）d，单纯性开腹组分别为（18．25±2．51）cm及（14．15±4．06）d，2组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论腹腔镜辅助下进行肝部分切除能达到微创效果，减少术后并发症。     

hTERT启动子调控p53基因表达逆转录病毒的抗肿瘤作用

目的：观察人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因启动子驱动野生型p53的新型逆转录病毒对肿瘤的杀伤作用。方法：先将前期构建的逆转录病毒穿梭质粒pLHCX-hTERT-EGFP和pLHCX-hTERT-wtp53进行包装，通过浓缩获得高滴度病毒液。然后将逆转录病毒pLHCX-hTERT-wtp53感染包含突变型p53的大肠癌细胞系SW620，通过RT-PCR和Western blot证实p53mRNA和p53蛋白的表达。最后将逆转录病毒pLHCX-hTERT-wtp53和pLHCX-hTERT-EGFP感染hTERT阳性的人大肠癌细胞株SW620，人肺癌细胞株A549和hTERT阴性的正常人胚肺成纤维细胞MRC-5，观察其特异性杀伤作用；另外通过裸鼠皮下注射肿瘤细胞SW620和A549，建立肿瘤模型，应用逆转录病毒pLHCX-hTERT-wtp53治疗后测量肿瘤体积计算肿瘤生长抑制率。结果：获得病毒液的滴度分别为2.3×10^7CFU·mL^-1和3.5×10^7CFU·mL^-1。逆转录病毒pLHCX-hTERT-wtp53经RT-PCR证实p53mRNA的表达，经Western blot检测到p53蛋白表达。重组逆转录病毒导入外源的野生型p53基因后，通过流式细胞检测到hTERT阳性人大肠癌细胞株SW620，人肺癌细胞株A549凋亡率远高于hTERT阴性的正常人胚肺成纤维细胞MRC-5（P〈0.05）。体内实验证实各组通过逆转录病毒pLHCX-hTERT-wtp53治疗后的肿瘤体积明显小于对照组（P〈0.05）。结论：获得的新型逆转录病毒对肿瘤有特异性的杀伤作用。     

原发性肝癌细胞中Rock2调控MMP2对其侵袭迁移的作用

目的 探讨Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶2 (Rho associated coiled coil containing proteinkinase 2,Rock2)调控基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP2)对肝癌细胞侵袭迁移能力的影响。方法 用Western blot法检测30例肝癌组织及对应癌旁组织中Rock2和MMP2的蛋白表达,同时分析它们之间的关联;用荧光定量PCR和Western blot法观察稳定降低Rock2细胞中MMP2 mRNA及蛋白表达变化;利用PCR定点突变技术构建Rock2同义突变质粒“恢复”稳定干扰Rock2的肝癌细胞中Rock2表达后检测MMP2蛋白表达变化;采用Transwell侵袭实验和划痕实验观察空白对照组、稳定低表达Rock2组、“恢复”Rock2组HepG2细胞侵袭和迁移能力变化。结果 Rock2和MMP2蛋白在肝癌组织中均比对应癌旁组织明显增高,且两者的表达呈正相关性。稳定降低肝癌细胞中Rock2的表达后发现MMP2的mRNA和蛋白表达也随之降低;另外,“恢复”稳定干扰Rock2的肝癌细胞中Rock2的表达,MMP2表达也“恢复”;同时证实Rock2通过调节MMP2表达从而影响肝癌细胞的侵袭和迁移。结论 在原发性肝癌细胞中降低Rock2可引起MMP2表达下降,进而抑制肝癌细胞的侵袭和迁移。     

FAT10真核质粒的构建、转染及其蛋白的表达

目的构建类泛素基因FAT10的真核表达质粒,观察其蛋白在转染人胚肾细胞系293T中的表达。方法采用RT-PCR法扩增FAT10全长基因片段后,克隆至pMD18-T载体进行测序分析,将FAT10克隆至pcDNA5-FRT表达载体并行酶切鉴定;用脂质体LipofectamineTM2000分别介导空质粒（空载组）及重组质粒（FAT10质粒组）转染293T细胞,以脂质体混合PBS（PBS组）及未加入脂质体（未转染组）作为对照。转染48 h后,收集细胞。采用Western blot法检测293T细胞中的FAT10蛋白。结果 pMD18-FAT10重组质粒经双酶切获得498 bp片段,对PCR产物及498 bp片段进行测序,结果与GenBank报道序列完全一致。FAT10质粒组、未转染组、空载体组和PBS组FAT10蛋白表达量分别为1.556±0.072、0.334±0.051、0.425±0.095、0.382±0.063,FAT10质粒组与未转染组、空载体组和PBS组比较,P均〈0.05。结论成功构建了FAT10的真核表达质粒pcDNA5-FRT-FAT10,FAT10蛋白在293T细胞中高表达。     

首次应用反转录病毒仅感染分裂细胞特性构建hTERT驱动野生型p53基因反转录病毒载体质粒***★

目的：研究表明ABO血型不合的异基因造血干细胞移植是安全的，但仍可能出现血液免疫学并发症。以同期ABO血型相合的受者作对照，分析ABO血型不合对异基因造血干细胞移植后红系重建的影响。 方法：①对象：选取解放军总医院1985-04/2006-04进行的异基因干细胞移植患者155例，ABO血型相合患者83例，ABO血型不合72例，包括主要不合32例，次要不合33例，主、次要双向不合7例。骨髓移植30例，外周血干细胞移植124例，骨髓+外周血干细胞移植1例。供受者对治疗均签署知情同意书，ABO血型相合与不合患者年龄、性别、原发病、疾病的缓解程度及预处理方案等基线资料差异均无显著性意义（P > 0.05）。②实验方法：行骨髓移植，ABO血型相合患者在全麻状态下采髓量1 010~1 430 mL，抗凝后当日回输；ABO血型主要和双向不合者用羟乙基淀粉沉降去除供者红细胞，次要不合者去除血浆，经静脉输注给受体。行外周血干细胞移植，供者使用重组人粒细胞集落刺激因子进行干细胞动员后，采集的干细胞悬液当日直接输注给患者。外周血中性粒细胞≥ 0.5×109 L-1时为植活时间；血红蛋白达100 g/L为红系恢复的标准；血小板恢复指血小板稳定于20×109 L-1以上。纯红细胞再生障碍性贫血的诊断标准是移植后网织红细胞数量< 1%的时间超过60 d，骨髓穿刺红系前体细胞缺失。③实验评估：分析细胞移植后造血重建、无病生存率及主要并发症发生率情况。 结果：①造血重建：细胞移植后，共4例发生纯红细胞再生障碍性贫血，其中ABO血型主要不合患者3例，双向不合患者1例。与ABO血型相合患者比较，ABO血型主要不合患者的粒细胞植活时间、血小板输注数量无明显变化（P > 0.05），红细胞输注量显著增加（P < 0.05），红系重建时间明显延长（P < 0.05）；ABO血型次要不合、双向不合患者上述4项指标的变化差异均无显著性意义（P > 0.05）。②无病生存率与主要并发症发生率：与ABO血型相合患者比较，ABO血型主要不合、次要不合、双向不合患者在细胞移植后1，3，5年的无病生存率均基本相似（P > 0.05）；急性移植物抗宿主病发生率、巨细胞病毒感染率均基本相似（P > 0.05）。 结论：ABO血型主要不合的异基因造血干细胞移植后可出现纯红细胞再生障碍性贫血，从而导致红系造血恢复迟缓及红细胞输注量增加，但对髓系和巨核系造血恢复无影响，与主要并发症的发生率和生存率无关。     

PTEN基因多态性与乙肝相关肝细胞癌的关系探讨

目的探讨第10号染色体同源丢失性磷酸酶—张力蛋白(PTEN)基因突变及多态性与乙肝相关肝细胞癌(HCC)易感性的关系。方法对60例乙肝相关肝细胞癌(HCC组)、70例乙肝病毒携带者(CHB组)及135例健康体检者(正常对照组)进行PTEN基因DNA测序及序列分析。结果 HCC组未发现PTEN基因突变,但发现4个多态性,即Ala34Cys、Leu57Phe、IVS8+G32T、T2281G。常见的PTEN基因多态性(频率>5%)且可能影响PTEN基因表达的Ala34Cys和IVS8+G32T位点各基因型频率及等位基因频率在各组之间相比,P均>0.05;单体型构建发现GCG、GCT、TGT、TGG等4种单体型,HCC组和正常对照组的GCG单体型分布相比,P<0.05,GCG单体型携带者发生肝癌的风险明显减小(OR=0.62,95%CI为0.40～0.95)。结论 PTEN基因突变可能与乙肝相关HCC无关,但携带GCG单体型者发生HCC的风险可能较小。     

siRNA对肝癌细胞异常表达FAT10基因的抑制效应研究

目的：探讨小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）对原发性肝癌（肝癌）细胞中异常表达的类泛素蛋白FAT10的抑制作用,研究其对肝癌细胞生长的影响。方法：针对FAT10基因设计4条siRNA序列,并转染至人肝癌细胞株Hep3B细胞,通过实时荧光定量PCR检测siRNA对FAT10基因表达的影响,使用四甲基偶氮唑蓝法检测siRNA对Hep3B细胞生长情况的影响,采用流式细胞术分析siRNA对Hep3B细胞周期变化的影响。结果：Hep3B细胞转染siRNA后,FAT10mRNA表达降低,Hep3B细胞的生长受到了明显的抑制,其生长主要停滞在G0／G1期,而S期和G2／M期细胞所占比例下降。结论：siRNA可抑制Hep3B细胞FAT10基因的表达,并抑制Hep3B细胞的生长。FAT10基因可能是调控肝癌基因表达的新的靶基因。     

FAT10基因在肝细胞癌中的表达和突变分析

目的：探讨FAT10基因在肝细胞癌中的表达和突变情况。方法：应用Western blot 检测60例肝癌患者癌和癌旁组织FAT10蛋白表达水平。采用DNA直接测序方法检测60例肝癌患者（癌和癌旁组织）和5种人肝癌细胞中FAT10基因编码区遗传变异情况。结果：在60例肝癌中,85%（51/60）的肝癌组织FAT10蛋白的表达明显高于癌旁组织。在60例肝癌患者和5种人肝癌细胞中检测到FAT10基因编码区存在7个单核苷酸多态性位点,未发现基因突变。结论：FAT10基因在中国人肝癌中存在表达上调,但未发现基因突变现象,提示FAT10在肝癌中的异常表达并不依赖于该基因突变,可能存在其他机制,有待于进一步研究。     

胰十二指肠切除术术后出血列线图预测模型的建立和验证

目的 分析胰十二指肠切除术（PD）术后出血的危险因素,构建预测PD术后出血的列线图模型。方法 回顾性分析2017年1月—2023年1月494例在南昌大学第二附属医院行PD患者的临床资料。将2017年1月—2020年12月收集的376例患者作为训练集,2021年1月—2023年1月118例患者作为验证集。通过单因素分析、Lasso回归分析和多因素一般Logistic回归分析筛选预测因素并构建列线图预测模型。通过受试者工作特征曲线下面积（AUC）、校正曲线和决策曲线分析（DCA）评估模型的鉴别能力、一致性和临床效果。结果 多因素一般Logistic回归分析结果显示,血管重建、术后胰瘘、术后胆瘘、腹腔感染和白蛋白为PD术后出血的独立风险因素（P <0.05）。由上述因素构建列线图预测模型在训练集的AUC为0.870（95% CI：0.820,0.920）,验证集AUC为0.799（95% CI：0.691,0.907）,提示模型诊断效能较好,在训练集和验证集中绘制出的校正曲线与标准曲线较为接近,提示模型一致性较好。绘制的DCA曲线也表明了明显的正向净收益。结论 通过血管重建、术后胰瘘、术后胆瘘和腹腔感染和白蛋白构建的列线图预测模型能够很好识别出PD术后出血的高风险患者,具有很好的临床应用价值。