PAX6对肝癌细胞HNF1α基因表达的调控作用

背景：前期研究显示肝细胞核因子1α（HNF1α）在人肝细胞癌（HCC）中表达下调,上调HNF1α表达可显著抑制HCC细胞增殖和小鼠肝脏原位移植瘤生长。然而HNF1α在HCC中表达下调的机制仍有待明确。目的：探讨HCC细胞中HNF1α基因表达调控的分子机制。方法：应用JASPAR软件预测HNF1α启动子上潜在的转录因子结合位点。联合应用含HNF1α启动子的报告基因系统荧光素酶活性检测和点突变技术,研究JASPAR软件预测的配对盒基因6（PAX6）对HNF1α启动子转录活性的影响;以染色质免疫共沉淀实验检测PAX6与HNF1α启动子的相互作用,实时荧光定量RT—PCR（qRT—PCR）和蛋白质印迹法验证PAX6对HepG2细胞内源性HNF1α表达的影响;qRT—PCR检测PAX6、HNF1α在人HCC组织样本中的表达,并以Spearman等级相关系数分析两者间的相关性。结果：PAX6可直接结合至HNF1α的启动子区域,在转录水平促进HNF1α表达。人HCC组织中PAX6表达明显降低,并与HNF1α表达呈显著正相关（rs=0．7530,P〈0．0001）。结论：PAX6可调控HCC细胞中的HNF1α基因表达,其表达下凋可能与HCC的发生、发展有关。     

PEP-1介导的重组肝细胞核因子4α蛋白转导对肝癌细胞的抑制作用

目的 利用细胞穿膜肽PEP-1介导重组肝细胞核因子4α（HNF4α）蛋白进入肝癌细胞,并明确外源融合蛋白P-HNF4α对肝癌细胞的作用。方法 构建表达质粒pET28a-P-HNF4α,优化原核表达体系的诱导条件,经大量表达、亲和层析纯化以及浓缩、透析后获得纯度较高的带有细胞穿膜肽PEP-1的融合蛋白P-HNF4α;P-HNF4α转导人肝癌细胞,Western blot检测其穿膜效率,核浆分离和细胞免疫荧光检测P-HNF4α的亚细胞定位,Real-time PCR检测肝癌细胞基因表达,CCK-8法检测肝癌细胞的增殖,细胞划痕实验以及小室侵袭实验检测P-HNF4α对肝癌细胞转移能力的影响。结果 细胞穿膜肽PEP-1成功介导融合蛋白P-HNF4α进入Huh7细胞并定位于细胞核;P-HNF4α蛋白可促进Huh7细胞肝功能基因的表达,抑制干细胞相关基因的表达,并显著抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。结论 P-HNF4α可诱导肝癌细胞向成熟肝细胞分化,降低肝癌细胞的恶性程度,提示利用P-HNF4α转导肝癌细胞是诱导分化治疗肝癌的潜在手段。     

RNA结合蛋白LIN28A对肝癌细胞转移能力的影响

目的研究LIN28A基因在肝肿瘤细胞及二乙基亚硝胺(DEN)诱导的大鼠原发性肝癌中的表达变化,揭示其在肝癌发生发展过程中的作用。方法利用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测肝癌细胞及DEN诱导的大鼠原发性肝癌模型中LIN28A信使核糖核酸(mRNA)的表达;以携带LIN28A的慢病毒(lentivirus)载体感染肝癌细胞,侵袭小室实验(transwell assay)检测过表达LIN28A对肿瘤细胞转移能力的影响。结果 RT-PCR结果显示,LIN28A在肝癌细胞及大鼠原发性肝癌中表达量上调;侵袭小室实验表明,过表达LIN28A能明显提高肝癌细胞的迁移和侵袭能力。结论 LIN28A在肝癌细胞中的表达升高,对肝癌细胞的转移能力具有促进作用。     

腺相关病毒介导的肝细胞核因子1α过表达改善四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化

目的 探讨特异性上调肝细胞中肝细胞核因子1α(HNF1α)表达对四氯化碳(CCl4)诱导的小鼠肝纤维化的影响.方法 取18只C57/B6小鼠随机分为正常组、AAV8-TBG-Ctrl组和AAV8-TtBG-HNF1α组,每组6只.应用CCl4诱导制备小鼠肝纤维化模型,造模后AAV8-TBG-HNF1α组小鼠通过尾静脉注射带有甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子驱动表达HNF1α的腺相关病毒AAV8-TtBG-HNF1α特异性上调肝细胞中HNF1α的表达,AAV8-TBG-Ctrl组小鼠注射对照病毒AAV8-TBG.采用免疫组织化学法及qPCR检测各组小鼠HNF1α的表达,苏木素-伊红(H-E)染色、天狼猩红染色检测肝组织的病理改变及胶原沉积,免疫组化法检测旷平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,并对Ⅰ型胶原(COL1A1)及α-SMA的表达进行软件定量分析;qPCR法检测小鼠肝组织中纤维化相关基因(α-SMA和COL1A1)、上皮指标(E-cadherin和Plakoglobin)及间质指标(Vimentin,Slug和Twist1)的mRNA水平;免疫组化法及TUNEL法检测上调HNF1α对纤维化肝脏中细胞增殖、凋亡的影响.结果 与正常组小鼠相比,CCl4造模可促进小鼠肝脏胶原沉积及α-SMA的表达,且在肝纤维化发生过程中HNF1α的表达下降(P＜0.01);与AAV8-TBG-Ctrl组相比,应用AAV8-TBG-HNF1α特异性上调肝细胞HNF1α的表达可抑制纤维化肝脏中的COL1A1及α-SMA的水平(P＜0.01).上调肝细胞HNF1α表达对纤维化肝脏中E-cadherin、Vimentin等上皮间质转换指标的表达无明显影响(P＞0.05),也不影响肝细胞的增殖与凋亡(P＞0.05).结论 特异性上调肝细胞HNF1α表达可显著改善CCl4诱导的小鼠肝纤维化.     

基于报告基因系统的肝细胞核因子4α活性检测体系的建立

目的 建立一个基于荧光素酶报告基因系统的肝细胞核因子4α(HNF4α)活性检测系统,筛选可调控HNF4α活性的小分子化合物.方法 采用亲和层析法纯化HNF4α蛋白,行蛋白热迁移实验检测相关DNA片段及小分子化合物与HNF4α蛋白的直接相互作用.分别构建含有3个拷贝和9个拷贝的Ninjurin 1(NINJ1)基因启动子区HNF4α反应元件的荧光素酶报告基因质粒pGL3-NINJ1-3p和pGL3-NINJ1-9p,转染肝癌细胞,采用荧光素酶报告基因法检测肝癌细胞内HNF4α转录活性的改变,qPCR检测小分子化合物木犀草素或阿尔维林处理后肝癌细胞中HNF4α及下游基因的表达情况,荧光素酶报告基因法检测小分子化合物处理后细胞内HNF4α转录活性的改变.结果 蛋白热迁移实验证实,NINJ1基因启动子区HNF4α的DNA结合片段可与HNF4α蛋白结合.在过表达HNF4α的肝癌细胞中,pGL3-NINJ1-3p和pGL3-NINJ1-9p均可检测到肝癌细胞中HNF4α活性的改变,且pGL3-NINJ1-9p较pGL3-NINJ1-3p的检测灵敏度更高(P＜0.01).木犀草素和阿尔维林与HNF4α蛋白存在直接相互作用,分别下调和上调HNF4α靶基因;pGL3-NINJ1-9p可检测到木犀草素和阿尔维林对HNF4α转录活性的影响.结论 利用报告基因载体pGL3-NINJ1-9p成功建立了HNF4α活性的检测系统,为筛选调控HNF4α活性的小分子化合物等提供了基础工具.