内皮型一氧化氮合酶与血管结构及功能的相关性

目的:应用内部核糖体进入位点构建携带内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子的双基因表达载体,研究外源性基因内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子在人脐静脉内皮细胞ECV304中的转染表达,探讨内皮型一氧化氮合酶与血管结构及功能的相关性。方法:实验于2003-12/2004-12在南京鼓楼医院科研部完成。将Phcmvsp1a-enos中内皮型一氧化氮合酶基因和PcDNA-vegf中血管内皮生长因子基因定向克隆到真核表达载体PcDNA-ires中,构建重组质粒PcDNA-enos-ires-vegf,经酶切,聚合酶链反应扩增和部分DNA测序分析证实后,转染人脐静脉内皮细胞,硝酸还原酶法检测转染后细胞中一氧化氮和一氧化氮合酶活性,免疫组化和荧光双标记及westernblotting检测转染后细胞蛋白水平的表达,Trizol提取总RNA,反转录-聚合酶链反应测定转染后细胞mRNA水平的表达。结果:成功构建携带内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子的双基因表达载体PcDNA-enos-ires-vegf,双基因内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子在人脐静脉内皮细胞基因组中获得整合及表达。重组基因PcDNA-enos-ires-vegf组与对照组PcDNA-enos在一氧化氮含量和一氧化氮合成酶活性的表达差异无显著性意义。PcDNA-enos-ires-vegf转染细胞后转染效率为30%～40%。结论:双基因表达载体PcD     

用猪AMI模型研究荧光染料CFSE和Brdu作为移植细胞标记物的实用性

目的研究荧光染料CFSE和Brdu作为体内细胞移植标记物的实用性.方法构建猪急性心肌梗死(AMI)模型.用CFSE和Brdu对骨髓单个核细胞进行双标记,经冠状动脉回输至MI区.4周后,利用激光共聚焦显微镜和免疫组织化学法分别观察CFSE和Brdu的定位和标记情况.结果细胞移植4周后,发现Brdu阳性细胞多位于心肌疤痕形成区且MI区的新生血管内壁也出现阳性染色.在MI区可见CFSE标记的带绿色荧光的细胞,但背景色较高.结论在动物实验中,CFSE和Br-du均可作为移植细胞标记物,Brdu的标记效果优于CFSE,适于同时进行形态学和组织学研究.     

单细胞反转录酶聚合链式反应技术对胰岛干细胞标记物胰岛素促进因子的鉴别

目的:利用干细胞分化获得胰岛细胞后目前还没有较理想的鉴别方法,实验通过单细胞反转录酶聚合链式反应技术鉴别胰岛干细胞标记物胰岛素促进因子,以建立一种检测胰岛干细胞的有效方法。方法:实验于2001-10/2005-08在加拿大多伦多大学和南京大学附属鼓楼医院完成。①将收集培养2～4周的单个胰岛干细胞用于实验。②胰岛活性测定实验中,选择1×106分化的胰腺干细胞,用低浓度和高浓度葡萄糖分别刺激1～4h,检测12,14,24d培养液中胰岛素的浓度。③单细胞反转录酶聚合链式反应检测胰岛素促进因子基因实验中,选择12个单个胰腺干细胞进行检测,另取12个单个未分化的干细胞作为对照。聚合链式反应体系为20μL。聚合链式反应扩增反应条件为94℃预变性4min,94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸2min条件下循环35次。聚合链式反应产物以质量浓度为20g/L的琼脂糖凝胶电泳。结果:①分化的胰腺干细胞培养液中胰岛素浓度的检测:培养12,14,24d时培养液中胰岛素的浓度分别为42.6,68.2,73.5IU/L,随着时间的延长,呈逐渐升高的趋势。②单个胰岛干细胞胰岛素促进因子反转录酶聚合链式反应检测结果:12个单个胰岛干细胞中有7个胰岛素促进因子表达呈阳性,而作为对照的12个未分化干细胞均未检出,两者差异显著(P<0.001)。结论:采用单细胞反转录酶聚合链式反应检测方法为胰腺干细胞的鉴定和纯化提供了技术保障,证明单细胞反转录酶聚合链式反应是一种检测胰腺干细胞标记物的有效方法。     

应用免疫磁珠法分离人胚胎神经干细胞的培养及鉴定

目的:从流产胚胎中分离出神经干细胞并培养、扩增和进行鉴定,为神经干细胞移植寻找源泉。方法:实验于2001-02/2005-06在加拿大多伦多大学和南京大学附属鼓楼医院完成。收集流产的胎儿脑组织,备人胚胎大脑组织细胞悬液制免疫磁珠法分离神经干细胞,实验设计共随机选择24个分离的单个神经干细胞通过反转录酶聚合链反应技术的方法用DNA扩增仪检测单个细胞中nestin神经干细胞标记物,betaactin为内参对照。以结果:分离的人胚胎神经干细胞生长、扩增正常,nestin阳性细胞纯度极高。结论:免疫磁珠法对胚胎神经干细胞的分离,及反转录聚合酶链反应技术在神经干细胞鉴定中的应用是值得进一步探讨的途径。     

应用免疫磁珠法分离人胚胎神经干细胞的培养及鉴定

目的：从流产胚胎中分离出神经干细胞并培养、扩增和进行鉴定，为神经干细胞移植寻找源泉。方法：实验于2001-02／2005-06在加拿大多伦多大学和南京大学附属鼓楼医院完成。收集流产的胎儿脑组织，制备人胚胎大脑组织细胞悬液，免疫磁珠法分离神经干细胞，实验设计共随机选择24个分离的单个神经干细胞通过反转录酶聚合链反应技术的方法用DNA扩增仪检测单个细胞中nestin神经干细胞标记物，以beta actin为内参对照。结果：分离的人胚胎神经干细胞生长、扩增正常，nestin阳性细胞纯度极高。结论：免疫磁珠法对胚胎神经干细胞的分离，及反转录聚合酶链反应技术在神经干细胞鉴定中的应用是值得进一步探讨的途径。     

开拓肿瘤化疗的新思路——密集式低剂量化疗的启示

近年来密集式低剂量化疗在小剂量化疗的基础上开始在临床上应用，这种给药方式称节律性化疗（metronomic chemotherapy）。与传统的最大耐受量化疗不同，主要是剂量低，间歇期短，能持续应用。本文对密集式化疗的作用机制、药物种类、剂量、应用方式、持续时间、检测标记物、毒副作用等方面的现状和前景进行综述。     

内皮型一氧化氮合酶与血管结构及功能的相关性

目的：应用内部核糖体进入位点构建携带内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子的双基因表达载体，研究外源性基因内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子在人脐静脉内皮细胞ECV304中的转染表达，探讨内皮型一氧化氮合酶与血管结构及功能的相关性。方法：实验于2003-12／2004-12在南京鼓楼医院科研部完成。将Phcmvspla—enos中内皮型一氧化氮合酶基因和PcDNA—vegf中血管内皮生长因子基因定向克隆到真核表达载体PcDNA—ires中，构建重组质粒PcDNA—enos—ires-lvegf，经酶切，聚合酶链反应扩增和部分DNA测序分析证实后，转染人脐静脉内皮细胞，硝酸还原酶法检测转染后细胞中一氧化氮和一氧化氮合酶活性，免疫组化和荧光双标记及western blotting检测转染后细胞蛋白水平的表达，Trizol提取总RNA，反转录一聚合酶链反应测定转染后细胞mRNA水平的表达。结果：成功构建携带内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子的双基因表达载体PcDNA-enos-ires-vegf,双基因内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子在人脐静脉内皮细胞基因组中获得整合及表达。重组基因PcDNA-enos-ires-vegf组与对照组PcDNA-enos在一氧化氮含量和一氧化氮合成酶活性的表达差异无显著性意义。PcDNA-enos-ires-vegf转染细胞后转染效率为30％-40％。结论：双基因表达载体PcDNA-enos-ires-vegf的成功构建和双基因内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子在人脐静脉内皮细胞基因组中表达为研究内皮型一氧化氮合酶在血管结构与功能上所起上所起的作用奠定了基础。     

单细胞反转录酶聚合链式反应技术对胰岛干细胞标记物胰岛素促进因子的鉴别

目的：利用干细胞分化获得胰岛细胞后目前还没有较理想的鉴别方法，实验通过单细胞反转录酶聚合链式反应技术鉴别胰岛干细胞标记物胰岛素促进因子，以建立一种检测胰岛干细胞的有效方法。方法：实验于2001-10／2005-08在加拿大多伦多大学和南京大学附属鼓楼医院完成。①将收集培养2～4周的单个胰岛干细胞用于实验。②胰岛活性测定实验中，选择1&;#215;10^6分化的胰腺干细胞，用低浓度和高浓度葡萄糖分别刺激1～4h，检测12，14，24d培养液中胰岛素的浓度。③单细胞反转录酶聚合链式反应检测胰岛素促进因子基因实验中，选择12个单个胰腺干细胞进行检测，另取12个单个未分化的干细胞作为对照。聚合链式反应体系为20μL。聚合链式反应扩增反应条件为94℃预变性4min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min条件下循环35次。聚合链式反应产物以质量浓度为20g/L的琼脂糖凝胶电泳。结果：①分化的胰腺干细胞培养液中胰岛素浓度的检测：培养12，14，24d时培养液中胰岛素的浓度分别为42．6，68．2，73．5IU／L，随着时间的延长，呈逐渐升高的趋势。②单个胰岛干细胞胰岛素促进因子反转录酶聚合链式反应检测结果：12个单个胰岛干细胞中有7个胰岛素促进因子表达呈阳性，而作为对照的12个未分化干细胞均未检出，两者差异显著（P〈0．001）。结论：采用单细胞反转录酶聚合链式反应检测方法为胰腺干细胞的鉴定和纯化提供了技术保障，证明单细胞反转录酶聚合链式反应是一种检测胰腺干细胞标记物的有效方法。     

HCCR1和HCCR2可溶性蛋白在细菌中表达、纯化及在早期肝癌诊断中的应用

目的评估HCCR1和HCRR2克隆、细茵表达及可溶性蛋白的纯化及应用于早期肝癌诊断的可行性。方法cDNA克隆、表达、蛋白质的纯化、Westem blot分析用于评估HCCR1和HCCR2蛋白的生产，Elisa方法用检测血清抗原。结果HCCR1和HCCR2能够高水平地在细茵中表达，纯化的可溶性蛋白能用于生产抗体并应用于肝癌的早期诊断。结论HCCR1和HCCR2蛋白质可以在细茵中生产，并能成功地用于肝癌的早期诊断。