外源基因在大肠杆菌中表达效率的影响因素

人们运用基因工程技术已在大肠杆菌中成功地表达了许多重要的生物活性蛋白基因。但不同外源蛋白基因在大肠杆菌中的表达效率差异很大。本文综述了影响外源基因表达效率的一些常见因素,特别是对影响酬译起始的因素给予了更多的关注,同时总结了一些提高外源基因在大肠杆菌中表达效率的行之有效的方法。     

抗人肝癌单克隆抗体嵌合Fab在巴氏毕赤酵母中的高效分泌表达

目的:通过分步整合,用巴氏毕赤酵母表达抗人肝癌单克隆抗体(mAb)HAb18的嵌合Fab(cFab)片段。方法:将抗人肝癌mAbcFab/HAb18基因的原核表达载体pET32a/cFab中的CL和Fd段基因,分别亚克隆到酵母表达载体pPIC9K和pPICZαA中,构建重组质粒pPIC9K/CL和pPICZαA/Fd并测序鉴定。将重组质粒pPIC9K/CL和pPICZαA/Fd分步整合到酵母菌GS115的染色体上,经G418和Zeocin筛选高拷贝的转化子及鉴定Mut表型后,用含5mL/L甲醇的培养基诱导表达。结果:成功地表达抗人肝癌mAbHAb18的cFab,表达水平为26mg/L。Westernblot鉴定证实,表达产物具有良好的与HAb18结合的活性和特异性。结论:cFab/HAb18在巴氏毕赤酵母获得表达,为对其进一步大规模的生产和临床应用奠定了基础。     

嵌合轻链为模板导向筛选人源性抗肝癌抗体重链Fd片段

目的:利用噬菌体抗体库和导向选择技术,以抗HAb18G嵌合抗体轻链为模板,筛选人源性抗肝癌抗体Fd片段.方法:利用RT-PCR自肝癌患者外周血淋巴细胞中扩增全套人抗体重链Fd基因片段,克隆入含嵌合L链的展示载体pComb3X,建立人-鼠杂合Fab噬菌体抗体库.然后,利用大肠杆菌表达的非融合HAb18GE为抗原进行亲和筛选,利用pⅢ融合抗体的形式进行克隆鉴定,并对筛选出的杂合抗体进行初步的功能检测.结果:构建成功库容量为2×107PFU的杂合人-鼠噬菌体抗体库,利用非融合表达的HAb18GE进行6轮筛选.ELISA及流式细胞仪检测,其中7个克隆呈特异性阳性反应.其中克隆AP6-2和AP6-7亲和力较高,测序显示其基因序列相同,且与亲本抗体恒定区序列相同,属IgG2亚类,可变区属VH3家族.结论:通过本实验,利用嵌合轻链为模板,进行Fd片段替换,成功筛选到人源性抗体Fd片段.     

32P胶体持续低剂量率辐射对U87细胞的剂量生物效应

本研究尝试应用32P胶体对脑胶质瘤细胞U87进行持续低剂量率辐射,并分析其剂量生物效应. 一、材料与方法 1.U87细胞培养.U87细胞株由中国科学院上海细胞生物学研究所提供.应用96孔板进行细胞培养.     

32P胶体持续低剂量率辐射对U87细胞的剂量生物效应

本研究尝试应用32P胶体对脑胶质瘤细胞U87进行持续低剂量率辐射,并分析其剂量生物效应. 一、材料与方法 1.U87细胞培养.U87细胞株由中国科学院上海细胞生物学研究所提供.应用96孔板进行细胞培养.     

炎症因子与肿瘤伴随抑郁的研究进展

肿瘤患者常伴随不同程度的抑郁症状,研究发现炎症因子是肿瘤伴随抑郁发生发展的重要危险因素,主要的炎症因子包括白细胞介素、趋化因子、干扰素和肿瘤坏死因子等,不仅能发挥促进肿瘤生长、血管生成及转移等作用,还可促使患者产生神经炎症、改变神经递质代谢与神经内分泌轴功能等,在促进肿瘤进展的同时诱发与临床抑郁症症状重叠的疾病行为,进一步导致患者预后不良。本文就炎症因子在肿瘤伴随抑郁中的作用作一综述。     

肝癌相关抗原HAb18G反义RNA表达质粒的构建及克隆鉴定

目的 构建HAb18G反义RNA表达质粒载体。方法 用DNA重组技术将人HAb18G基因反向克隆到真核表达质粒PCI－neo中，构建成HAb18G反义RNA表达质粒PCI－asHAb18G。用阳离子脂质体介导转染人肝癌细胞系HHCC，经G418筛选后获得的克隆进行鉴定。结果 HAb18G反义RNA表达质粒载体PCI－asHAb18G经限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确。流式细胞仪及免疫组化SP法染色均证实：转染细胞HHCC／asHAb18G中HAb18G表达为阴性，而转染空载体的HHCC／neu及HHCC均为强阳性。结论 成功构建了HAb18G反义RNA表达质粒载体PCI－asHAb18G。为进一步研究HAb18G蛋白分子的生物学功能及肝癌的基因治疗研究奠定了基础。     

肝动脉缺氧促进大鼠肝脏纤维组织生成的实验研究

目的 观察肝动脉结扎术后缺氧对大鼠肝脏纤维组织生成的影响,初步探讨缺氧促进肝纤维化形成的机制.方法 将Sprague Dawley(SD)大鼠20只,随机分为对照组和肝动脉结扎(hepatic artery ligation,HAL)组各10只,术后第14天处死并取肝组织,采用苏木精-伊红(hematoxylineosin,HE)、天狼星红-苦味酸染色观察肝组织病理学改变,同时采用碱水解法检测肝羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP) 及胶原蛋白含量,并通过免疫组化染色检测缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor1α,HIF1α)的表达.结果 采用SPSS16.0统计软件进行分析发现,HAL组大鼠肝脏纤维组织增生程度较对照组明显增高(U =0.000,P < 0.05).HAL组大鼠肝脏HYP含量[(87.58±12.46) μg/g vs (60.83±9.71) μg/g,t=5.355,P < 0.05]及HIF1 α的表达[(337.84±89.23) vs (177.15±49.40),t=11.140,P < 0.05]显著高于对照组.结论 HAL导致的缺氧促进大鼠肝纤维化生成,HIF-1α可能在其中起到重要作用.     

人源噬菌体Fab抗体库构建过程中引物的优化和初步鉴定

目的 优化设计一套引物，扩增全套人抗体Fd片段和L链基因，改善扩增效率，益于人源噬菌体抗体库的构建。方法 根据V-BASE数据库提供的人抗体可变区胚系基因，在其家族分类基础上，根据FR1区5’端保守序列重新分组，设计特异性的5’端扩增引物。同时对设计引物的匹配情况进行分析，并应用PCR扩增和测序反应对其扩增效果进行鉴定。结果 Fd链5’端扩增引物有5条，κ轻链有6条5’端扩增引物，而λ轻链5’和3’扩增引物有10条。分析表明，人抗体可变区胚系基因与5’引物有较好的匹配率，数目较少，匹配率较高。PCR结果显示，全部的重链及轻链引物对均能高效扩增出特异性较高的目的片段。测序结果表明PCR扩增产物具有较好的亚类和可变区家族分布。结论 优化了一套扩增全套人抗体Fd片段和L基因的引物，为人源噬菌体抗体库的构建奠定了良好的基础。