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目的:以羧基化琼脂磁珠为筛选介质,利用RT-PCR和靶标替换消减SELEX技术从胃癌血清中筛选得到高特异性?强亲和力的适配体?方法:以离心超滤(50 000超滤管)法处理后的胃癌血清作为靶分子,羧基化琼脂磁珠为载体,先将寡核苷酸文库与反筛磁珠(结合正常血清)结合,取上清再与筛选磁珠(结合胃癌血清)结合,洗去未结合的寡核苷酸分子,对结合在磁珠上的寡核苷酸分子进行分离和扩增,λ酶切法制备ssDNA次级库,进行10轮筛选,将第10轮的文库扩增得到dsDNA,利用胶回收试剂盒回收纯化目的片段的dsDNA,并与pMDTM18-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆,测序获得适配体序列,同时用流式细胞术测定胃癌血清适配体的Kd值?结果:经过10轮筛选后,得到20条与胃癌血清结合的适配体?结论:特异性检测表明,筛选得到的胃癌血清适配体与胃癌血清的结合解离常数均在纳摩尔级水平,其中5?7?16?17?18号适配体能高特异性?强亲和力结合胃癌血清,与正常人血清不结合?该研究为胃癌的早期诊断提供了实验基础? 相似文献
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目的:筛选癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)特异性单克隆抗体(Anti-CEA)的核酸适配体(aptamers),为肺癌血清肿瘤标志物核酸适配体的筛选奠定实验基础?方法:利用羧基化琼脂磁珠作为筛选介质,以Anti-CEA为筛选的目标靶分子,通过消减SELEX技术及实时定量PCR技术,从随机ssDNA文库中筛选出与Anti-CEA特异性结合的aptamers,并通过凝胶阻滞实验(EMSA)鉴定筛选到的Anti-CEA-aptamer复合物,然后将得到的第10轮富集文库扩增为双链DNA,通过切胶纯化后,连接PMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,同时利用交错PCR技术鉴定阳性克隆,经测序,获得aptamers的序列?结果:经过10轮筛选得到了4条与Anti-CEA结合的aptamers,测序结果显示均为不同序列?结论:验证筛选出的与Anti-CEA结合的aptamer,特异性检测结果表明2号aptamer与靶分子结合的特异性很高,且与非特异蛋白无明显吸附,筛选出的aptamers用于识别Anti-CEA,将为肺癌的早期诊断和早期治疗提供新的突破口? 相似文献
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目的:肝癌血清中含有已知和未知的标志物,可以作为SELEX筛选的靶标,获得一组已知和未知肝癌血清标志物的适配体,为肝癌早期诊断提供新的分子生物学检测方法。方法:收集50例经诊断证实为原发性肝癌患者的血清,以及50例体检无异常的正常人血清,并分别等比例混合制备成肝癌混合血清和正常人混合血清,作为筛选的靶标分子,磁珠作为分离载体。先将磁珠-正常人血清复合物与ssDNA文库结合,取上清再与磁珠-肝癌血清结合,经过洗脱、分离与肝癌血清结合的特异性ssDNA,并进行扩增,链霉亲和素磁珠法制备次级ssDNA,进行9轮筛选,将9轮筛选获得的饱和文库与PMD18-T载体连接进行转化、挑选单克隆团送上海生工进行测序,同时利用流式细胞术测定肝癌血清肿瘤标志物适配体的亲和力(Kd值)。结果:经9轮筛选,成功分离出200个核酸序列,其中序列不同的有10个。结论:特异性检测表明,筛选得到的肝癌血清肿瘤标志物适配体与肝癌血清的结合解离常数均在纳摩尔级水平,其中Seq-1、Seq-16、Seq-17、Seq-56、Seq-72号适配体能高特异性结合肝癌血清,与正常人血清不结合,再通过200例肝癌血清和200例正常人血清进一步鉴定5条肝癌血清肿瘤标志物适配体检出肝癌的阳性率,阳性检出率达91%以上,为肝癌的早期诊断提供了新方法。 相似文献
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目的:采用指数富集的配基系统进化技术(SELEX)筛选获得一组已知和未知肝癌血清肿瘤标志物的适配体,为肝癌的早期诊断提供新的便捷方法。方法:收集50例首次经诊断证实为原发性肝癌的患者血清,以及50例体检无异常的正常人血清,并分别等比例混合制备成肝癌混合血清和正常人混合血清,作为筛选的靶标分子,磁珠作为分离载体。先将磁珠?正常人血清复合物与ssDNA文库结合,取上清再与磁珠?肝癌血清结合,经过洗脱、分离与肝癌血清结合的特异性ssDNA,并进行扩增,链霉亲和素磁珠法制备次级ssDNA,进行9轮筛选,将9轮筛选获得的饱和文库与PMD18?T载体连接进行转化、挑选单克隆送上海生工进行测序,同时利用流式细胞术测定肝癌血清肿瘤标志物适配体的亲和力(Kd值)。结果:经9轮筛选,成功分离出200个核酸序列,其中序列不同的有10个。特异性检测表明,筛选得到的肝癌血清肿瘤标志物适配体与肝癌血清的结合解离常数均在纳摩尔级水平,其中Seq?1、Seq?16、Seq?17、Seq?56、Seq?72号适配体能高特异性结合肝癌血清,与正常人血清不结合,再通过200例肝癌血清和200例正常人血清进一步鉴定5条肝癌血清肿瘤标志物适配体检出肝癌的阳性率,阳性检出率达91%以上。结论:利用随机单链寡核苷酸文库成功获得与肝癌患者血清特异性结合的适配体,所获得的适配体具有拮抗肝癌血清的能力,有可能为肝癌的早期诊断提供新的便捷方法。 相似文献
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