血液系统恶性肿瘤多肽类疫苗的研究进展

近年来血液系统恶性肿瘤的治疗有了显著进展,但由于微小残留病灶(MRD)的存在,复发仍是亟待解决的主要问题.肿瘤多肽疫苗是有望克服MRD的免疫疗法之一.本文重点介绍血液系统恶性肿瘤中WT1、RHAMM、BCR-ABL、PR1多肽疫苗的最新临床试验结果,PRAME、Survivin等多肽的特异性免疫反应新进展,及不规则肽疫苗、新型免疫佐剂、结合肽疫苗、Ad-tWT1疫苗等增强疫苗免疫治疗效应的最新措施及其应用前景.     

线粒体通路和死亡受体通路在中华眼镜蛇毒组分诱导KG1a细胞凋亡中的作用

目的研究线粒体通路和死亡受体通路在中华眼镜蛇毒组分(naja naja actra venom component,NNAVC)诱导KG1a细胞凋亡过程中的作用。方法以人急性髓系白血病细胞株KG1a细胞为研究对象,采用Annexin V-FITC/PI荧光染色法进行凋亡细胞的形态学观察,流式细胞仪检测细胞凋亡率,分光光度法检测Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3的活性,ELISA法检测胞质内细胞色素C的表达水平,流式细胞仪分析TRAIL死亡受体(DR4、DR5)和诱骗受体(DcR1、DcR2)的改变。结果 NNAVC作用后,荧光显微镜下可见明显的凋亡细胞,细胞凋亡率随药物作用浓度的增加而升高;Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3蛋白被激活,胞质内细胞色素C的表达明显增加;流式细胞仪检测结果显示,NNAVC具有降低死亡受体DR4和诱骗受体DcR1的表达率,而提高DR5和DcR2的表达水平的作用。结论线粒体凋亡通路和死亡受体通路均参与NNAVC诱导KG1a细胞凋亡的过程,这可能是NNAVC发挥抗白血病作用的机制之一。     

冬凌草甲素诱导人多发性骨髓瘤ARH-77细胞凋亡及其可能机制

摘 要 目的：探讨冬凌草甲素（oridonin,Ori）对人多发性骨髓瘤ARH-77细胞的致凋亡作用及其可能的机制。方法：不同浓度Ori（2.5、5、10 μmol/L）作用于ARH-77细胞,MTT法检测ARH-77细胞的增殖,相差显微镜和Hoechst 33258染色观察细胞凋亡的形态学改变,流式细胞术检测ARH-77细胞的早期凋亡及线粒体膜电位（Δψm）的变化,caspase 8凋亡试剂盒检测ARH-77细胞caspase 8的活化。结果：Ori对ARH-77细胞的生长有明显的抑制作用,且呈时间和剂量依赖性。10 μmol/L Ori作用于ARH-77细胞24 h后可见细胞变小、胞质中出现空泡,并可见凋亡小体。流式细胞术结果显示,经不同浓度Ori（2.5、5、10 μmol/L）处理后,细胞早期凋亡率分别为（15.07±0.78）%、（21.00±1.49）%和（27.45±2.47）%,均高于对照组的（5.27±1.46）%（P<0.01）。不同浓度Ori（2.5、5、10 μmol/L）处理后,反映Δψm的绿色荧光细胞百分率分别为（26.80±0.75）%、（36.81±2.27）%和（49.48±1.10）%,均高于对照组的（16.96±0.50）%（P<0.01）,提示ARH-77细胞凋亡有显著增加。同时,Ori处理可上调ARH-77细胞caspase 8的活性（P<0.01）。结论：冬凌草甲素能明显诱导多发性骨髓瘤ARH-77细胞的凋亡,其机制可能与激活内、外源凋亡通路有关。     

中华眼镜蛇毒组分联合活化免疫细胞对白血病KG1a细胞的杀伤作用

本研究旨在探讨中华眼镜蛇毒组分（Naja Naja Actra Venom Component,NNAVC）与活化免疫细胞联合对人急性髓系白血病系KG1a细胞的杀伤作用.采用CCK-8法检测不同浓度NNAVC对KG1a细胞的杀伤作用,乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒测定活化免疫细胞对KG1a细胞的细胞毒作用、NNAVC与活化免疫细胞联合杀伤KG1a细胞以及NNAVC作用后存活的KG1a细胞对活化免疫细胞的杀伤敏感性变化.结果显示,NNAVC对KG1a细胞的抑制率随药物浓度的增加而增高,而活化免疫细胞对KG1a细胞的杀伤活性随效靶比的升高（6.25∶1、12.5∶1和25∶1）分别达到12.30％、24.85％和52.26％.NNAVC与不同效靶比（10∶1、20∶1）的活化免疫细胞联合,对KG1a细胞的杀伤率达到56.21％和85.59％,高于两因素各自的单独作用效果.以不同浓度NNAVC杀伤后存活的KG1a细胞为靶细胞,活化免疫细胞对其杀伤活性在效靶比为10∶1时分别为25.65％、31.33％、28.63％和16.78％,在效靶比为20∶1时分别为40.62％、44.70％、44.62％、40.72％.结论：NNAVC与活化免疫细胞在体外均可以有效杀伤KG1a细胞,二者联合应用能够增强对KG1a细胞的杀伤作用.     

舒尼替尼诱导耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞表达NKG2DLs的机制

目的：初步探讨舒尼替尼诱导高、低表达ABCG2(ATPbinding cassette superfamily G member 2)分子的耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞（简称ABCG2highCNE2/DDP细胞、ABCG2lowCNE2/DDP细胞）中NKG2D配体（natural killer group 2 member D ligands,NKG2DLs）表达的分子机制。方法：Caspase8活化试剂盒和线粒体膜电位法分别检测NK细胞处理后ABCG2highCNE2/DDP细胞和ABCG2lowCNE2/DDP细胞caspase8活化水平和线粒体膜电位。RTPCR检测舒尼替尼处理前后两种CNE2/DDP细胞DNA损伤修复系统相关信号分子mRNA的表达。结果：CNE2/DDP细胞+NK细胞组中两种CNE2/DDP细胞caspase8活性均明显增强;舒尼替尼处理后的ABCG2low CNE2/DDP细胞+NK细胞组和ABCG2highCNE2/DDP细胞＋NK细胞组中caspase8的活性是处理前的2～2.5倍（P<0.01）。舒尼替尼预处理后,CNE2/DDP细胞和NK细胞共培养体系中两种CNE2/DDP细胞的线粒体膜电位分别为(76.58±2.32)%和(73.11±1.93)%,较舒尼替尼处理前明显降低（P<0.05）。舒尼替尼可上调两种CNE2/DDP细胞中ATR、CHK1和CHK2 mRNA的表达,并诱导P53和NFκB mRNA的表达。结论：舒尼替尼可能通过激活DNA损伤修复系统相关信号分子和NFκB的表达,诱导耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞NKG2DLs的表达,同时经由死亡受体信号通路和线粒体信号通路增强NK细胞诱导的肿瘤细胞凋亡。     

D-半乳糖致衰老大鼠骨髓间充质干细胞的特性

目的:观察D-半乳糖致衰老大鼠骨髓来源的间充质干细胞的形态学及生物学改变.方法:选择SPF级雄性SD大鼠10只, 随机分为2组:青年对照组和衰老模型组.衰老模型组大鼠每天用D-半乳糖颈背部皮下注射, 剂量为400 mg/kg, 连续注射4个月.分别从青年对照组和衰老模型大鼠的骨髓中培养出间充质干细胞(BMSCs).倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况, 流式细胞术(FCM)检测表面抗原, 比较两组原代细胞集落形成数量和增殖情况, 透射电镜下观察其形态和结构变化.结果:两组体外培养的原代和第3代骨髓间充质干细胞在形态上无差异,早期呈集落样生长.FCM检测显示, 两组BMSCs的免疫表型一致, CD29和CD44为阳性表达, CD34. 和CD45为阴性表达.两组细胞都具有成骨诱导和成脂诱导能力.与青年对照组相比, 衰老模型组BMSCs生长速度明显减慢, 集落形成能力明显地降低(P<0. 05).透射电镜观察发现, 衰老模型组BMSCs呈现衰老的 形态和结构变化, 核膜内折, 细胞质内存在大量空泡, 内质网和线粒体增大或肿胀.结论:大鼠骨髓间充质干细胞的增殖随年龄增长而降低;体外培养的衰老模型组骨髓间充质干细胞出现衰老征象.     

去甲斑蝥素联合IL-12、IL-15处理增强PBMC对Raja细胞的杀伤效应【创新点评：中药抗癌药物去甲斑蝥素增强PBMC对淋巴瘤的杀伤－郑胡镛】

目的:探讨细胞因子IL-2、IL-15激活的人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)对去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)处理后的人Burkitt淋巴瘤Raji细胞的杀伤效应及其可能机制.方法:锥虫蓝拒染法检测NCTD对Raji细胞和PBMC细胞增殖的影响;LDH释放法检测IL-2、IL-15激活后的PBMC对K562细胞和Raji细胞的杀伤;流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测IL-2、IL-15诱导后PBMC表面NKG2D的表达,以及NCTD作用前后Raji细胞表面NKG2D配体(MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3)的表达.结果:NCTD抑制Raji细胞的增殖,具有剂量、时间依赖性(P＜0.05),但对PBMC增殖无影响(P＞0.05).在效靶比为10∶1、20∶1时,IL-2、IL-15激活的PBMC对K562细胞的杀伤率较未激活的PBMC明显增高[(52.42±3.89)％vs (15.82±5.12)％,(79.55±9.22)％vs(27.67±3.66)％,P＜0.05];PBMC对NCTD处理后Raji细胞杀伤率较未经NCTD处理的Raji细胞明显增高[(23.63±6.20)％vs (5.04±1.25)％,(41.80±4.09)％ vs (8.59±2.19)％;P＜0.05],且IL-2、IL-15激活的PBMC对NCTD处理后Raji细胞的杀伤率较NCTD处理前明显提高[(38.97±2.76)％ vs(13.19±3.67)％,(63.09 ±7.30)％ vs(19.89 ±4.15)％;P＜0.05].激活后PBMC表面NKG2D表达率升高[(44.91±5.85)％vs (25.28±7.69)％,P＜0.05].NCTD作用后Raji细胞表面NKG2D的配体ULBP2表达显著升高[(12.69±3.99)％vs(1.03 ±0.42)％,P＜0.05],而其他配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP3的表达无明显变化(P＞0.05).结论:NCTD联合细胞因子IL-2、IL-15处理能增强PBMC对Raji细胞的杀伤效应,其机制与NCTD上调Raji细胞表面ULBP2表达和细胞因子上调PBMC表面NKG2D表达有关.     

siRNA干扰NF-кB家族成员表达抑制人肝癌HepG2细胞表达NKG2DLs

目的：探讨舒尼替尼诱导人肝癌HepG2细胞表达的自然杀伤细胞2族成员D配体（natural killer group 2 member D ligands,NKG2DLs）与核因子kappa B（nuclear factor B kappa, NF-κB）信号通路之间的相互作用。方法：常规体外培养HepG2细胞,利用实时荧光定量PCR检测1 μmol/L舒尼替尼处理HepG2细胞24 h前后NF-κB基因家族成员 mRNA的表达情况,利用计算机辅助设计并合成NF-κB1、NF-κB2和RelB siRNA引物,通过脂质体法将目的基因siRNA转染于HepG2细胞,荧光显微镜观察转染情况,实时荧光定量PCR检测干扰效率,Western blotting检测siRNA转染前后HeG2细胞内NF-κB1、NF-κB2和RelB蛋白表达,流式细胞术检测siRNA前后HepG2细胞NKG2DLs表达率。结果： 实时荧光定量PCR结果显示,舒尼替尼处理HepG2细胞后,NF-κB1、NF-κB2和RelB mRNA表达水平升高,主要以NF-κB2 mRNA和RelB mRNA升高为主。荧光显微镜观测siRNA转染后HepG2细胞红色荧光表达率约为60%,干扰效率达95%以上。siRNA转染后HepG2细胞内NF-κB1、NF-κB2和RelB蛋白表达水平明显下降,siRNA转染+药物组NKG2DLs表达率明显低于药物处理组（P<0.05）。结论： 首次揭示了舒尼替尼通过NF-κB旁路途径诱导肿瘤细胞表达NKG2DLs。     

和厚朴酚诱导人急性髓性白血病 KG1a细胞凋亡

目的:探讨和厚朴酚(honokiol,HNK)对人急性髓性白血病KG1a细胞凋亡的影响及其可能的机制。方法:XTT法检测不同质量浓度HNK对KG1a细胞增殖的影响,流式细胞术检测不同质量浓度HNK作用后KG1a细胞的细胞周期及凋亡,RT-PCR法检测KG1a细胞Bcl-2、Bid、Bax、Bak、Bad、P53、NF-κB等凋亡相关基因的表达。结果:HNK(2.5、5、8、10、15、20、40μg/ml)对KG1a细胞的增殖有明显抑制作用,且呈时间和剂量依赖性(P<0.01),其中24、48 h的半数抑制浓度(IC50)分别为10.23、8.25μg/ml。流式细胞术结果显示,经HNK(5、10μg/ml)处理后,KG1a细胞被阻滞在G0/G1期,早期凋亡率分别为(11.16±1.27)%和(21.46±3.13)%,显著高于对照组的(6.03±1.10)%(P<0.01)。RT-PCR检测结果显示,HNK(10μg/ml)处理后KG1a细胞内促凋亡基因Bax表达显著上调,Bad轻度上调;抗凋亡基因NF-κB表达显著下调。结论:HNK能诱导人急性髓性白血病KG1a细胞凋亡,其机制可能与Bax、Bad基因表达上调及NF-κB基因表达下调有关。