荧光定量聚合酶链反应检测人类疱疹病毒7型方法的建立及应用

1990年，首次从健康人外周血单个核细胞中分离到人类疱疹病毒7型(human herpes virus type 7，HHV-7)。HHV-7为双链DNA病毒(145kh)，主要感染CD4^ 淋巴细胞、唾液腺。HHV-7感染可引发婴儿急疹、热性癫痫发作、慢性疲劳性综合征和单核细胞增殖异常等。HHV-7与HHV-6同属人类β-疱疹病毒，两者在细胞病变特点和分离培养条件方面相似，HHV基因诊断是目前较理想的诊断和鉴别诊断方法。传统定性聚合酶链反应(PCR)技术曾被广泛应用于临床诊断，但存在不能定量、特异性不够等缺陷。     

特发性血小板减少性紫癜与人类疱疹病毒6型感染关系初探

目的：了解特发性血小板减少性紫癜与人类疱疹病毒6型（HHV－6）感染间的关系。方法：聚合酶链反应（PCR）检测特发性血小板减少性紫癜（ITP）骨髓，外周血中的HHV－6－DNA健康体检者和缺铁性贫血者为对照组。结果：20例ITP患者，10例缺铁性贫血患者和30例健康体检者外周血的HHV－6－DNA检出率分别为25％（5／20），10％（1／10）和3．33％（1／30），ITP患者组与健康体检组间，差异有显著性（P＜0．05）。ITP患者组与缺铁性贫血组间差异无显著性。15例ITP患者骨髓和10例缺铁性贫血患者骨髓，HHV－6－DNA检出率分别为46．67％（7／15）和0，二者间差异有显著性（P＜0．05）。10例ITP治疗前，治疗后第5天，第10天时外周血HHV－6－DNA检测，分别有3，3，2例阳性。结论：ITP与HHV－6的感染呈正相关，骨髓中HHV－6－DNA检出率高于外周血中     

实时荧光聚合酶链反应检测乙肝病毒YMDD变异标本影响因素的研究

目的探讨标本贮存温度、血红蛋白、高胆红素因素对熔解曲线法检测HBV-YMDD变异结果的影响。方法服用拉米夫定出现YMDD变异株的慢性乙型肝炎患者的血清,在不同的贮存温度、血红蛋白、胆红素浓度下,用杂交探针溶解曲线法检测,观察其荧光扩增曲线的Ct值及熔解曲线的Tm值。结果在4℃和25℃贮存的血清标本,其Ct值与对照组比较有显著性差异(P<0.001);在-20℃贮存温度下,其Ct值与对照组比较无显著性差异(P>0.05);Hb浓度为60μg/L及600μg/L的血清标本,其Ct值与空白对照组比较均有显著性差异(P<0.001);胆红素浓度为25.6μg/L及45.2μg/L的血清标本,其Ct值与对照组比较均有显著性差异(P<0.001)。熔解曲线的Tm值与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)。结论标本贮存温度、血红蛋白、高胆红素因素对实时荧光聚合酶链反应检测乙肝病毒YMDD变异结果有影响,尤其是低拷贝HBV-DNA的血清标本,上述因素可能会导致结果的假阴性;对基因分型特异性无明显影响。     

乳腺癌患者外周血CK19基因表达的检测及临床价值分析

目的探索外周血CK19基因表达的检测及在乳腺癌诊断中的应用价值。方法应用逆转录结合荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测乳腺癌MDA-MB453细胞株血液标本模型和280例临床标本的CK19表达,同时检测三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)表达作为PCR方法的监控指标。结果逆转录结合FQ-PCR检测MDA-MB453细胞株血液标本模型的灵敏度为107个血细胞中含1个乳腺癌细胞的水平。280例外周血临床标本的CK19表达,乳腺癌组(38/120)与非乳腺癌组(20/80)比较,差异无统计学意义(P>0.05);乳腺癌组(38/120)与正常对照组(2/80)比较,差异有统计学意义(P<0.01);乳腺癌淋巴结转移组(21/53)与未见淋巴结转移组(17/67)比较,差异无统计学意义(P>0.05);乳腺癌术后2年以上者,复发组(3/9)与未复发组(6/31)比较,差异也无统计学意义(P>0.05)。GAPDH表达均阳性。结论CK19是上皮细胞性癌细胞的较特异指标,诊断乳腺癌的特异性不强,但可用作病理学检查的补充,或结合其他特异性指标共同诊断乳腺癌微转移和复发,具有一定的价值。     

特发性血小板减少性紫癜与人类疱疹病毒6型感染关系初探

目的:了解特发性血小板减少性紫癜与人类疱疹病毒6型(HHV-6)感染间的关系。方法:聚合酶链反应(PCR)检测特发性血小板减少性紫癜(ITP)骨髓、外周血中的HHV-6-DNA,健康体检者和缺铁性贫血者为对照组。结果:20例ITP患者、10例缺铁性贫血患者和30例健康体检者外周血的HHV-6-DNA检出率分别为25％(5/20)、10％(1/10)和3.33％(1/30),ITP患者组与健康体检组间,差异有显著性(P<0.05)。ITP患者组与缺铁性贫血组间差异无显著性。15例ITP患者骨髓和10例缺铁性贫血患者骨髓,HHV-6-DNA检出率分别为46.67％(7/15)和0,二者间差异有显著性(P<0.05)。10例ITP治疗前、治疗第5天、第10天时外周血HHV-6-DNA检测,分别有3、3、2例阳性。结论:ITP与HHV-6的感染呈正相关;骨髓中HHV-6-DNA检出率高于外周血中。     

体外siRNA抑制乳腺癌细胞株端粒逆转录酶基因的表达

目的:筛选能高效抑制乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-453端粒逆转录酶(hTERT)基因表达的RNA干扰靶点,为乳腺癌的基因治疗提供依据.方法:构建针对hTERT基因的三种siRNA(siRNA-hTERT1,siRNA-hTERT2和siRNA-hTERT3),分别转导入乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-453.同时以无同源性的siRNA-hTERT4作阴性对照,含GFP基因的载体作阳性对照.应用实时聚合酶链反应(real-time PCR)和Western Blot技术检测siRNA处理前后hTERT基因表达变化;MTT法检测细胞生长率;流式细胞术分析基因沉默对细胞凋亡的影响.结果:与阴性对照组相比,siRNA-hTERT1,siRNA-hTERT2和siRNA-hTERT3三个实验组siRNA转染细胞后,hTERT的mRNA表达量下调至21%～40%,蛋白表达下降至50%,而三个实验组间差异无统计学意义(P>0.05).转染48 h后,MCF-7细胞抑制率分别为(57±4.3)%,(61±4.3)%,(65±6.0)%;MDA-MB-453细胞抑制率分别为(45±5.1)%,(45±4.1)%,(50±4.0)%.流式细胞仪检测结果显示,细胞凋亡率有所增加,MCF-7细胞为(18.90±0.11)%,(27.30-I-0.18)%,(27.00 4-0.16)%;MDA-MB-453细胞为(12.25 4-0.17)%,(17.80±0.19)%,(20.60 4-0.21)%.结论:经siRNA-hTERTl,siRNA-hTERT2,siRNA-hTERT3处理均可明显抑制MCF-7和MDA.MB-453乳腺癌细胞的增殖及hTERT基因的表达,能够明显促进细胞的凋亡.     

体外RNA干扰人乳腺癌细胞端粒酶逆转录酶基因表达及促凋亡的研究

我们以乳腺癌MDA-MB-453细胞株为模型,用小片段RNA(siRNA)特异性抑制人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的表达,了解其促肿瘤细胞凋亡的效果.     

小分子干扰核糖核酸抑制乳腺癌细胞端粒酶逆转录酶表达提高阿霉素化疗的敏感性

人端粒酶逆转录酶(bTERT)是端粒酶活性的限速酶[1].抑制hTERT表达可有效抑制端粒酶活性[2],增加化、放疗的敏感性[3].本研究旨在研究hTERT基因表达被干扰后,阿霉素化疗敏感性的变化.     

外周血TSGF及hMAM表达指标监测乳腺癌微转移价值初探

目的探索TSGF和hMAM表达指标对乳腺癌细胞外周血微转移诊断的应用价值。方法分离受检者外周血单个核细胞,TRIZOL液提取总RNA,作RT-PCR并用-βactin监控;确认的cDNA先作普通PCR扩增,再作荧光定量PCR扩增。血清作TSGF检测。结果64例标本有63例确认转录为cDNA,其中乳腺癌43例、良性乳腺肿瘤和正常对照各10例。经普通PCR后再作荧光定量PCR,乳腺癌hMAM表达阳性率为53.3%、良性乳腺肿瘤和正常对照均无阳性,乳腺癌组与良性乳腺肿瘤或正常对照组间hMAM表达有显著差异;淋巴结转移组与未转移组,hMAM表达有显著差异。TSGF阳性率为1.6%,乳腺癌组与良性乳腺肿瘤组及正常对照组间无显著差异。结论二次PCR的灵敏度可成功检出外周血hMAM的表达,而单次PCR法的灵敏度不够;外周血hMAM表达指标可用于监测乳腺癌细胞微转移,但未见TSGF指标对乳腺癌微转移的监测价值。     

骨桥蛋白检测用于乳腺癌诊断的临床价值

目的检测乳腺癌组织及血清中骨桥蛋白(OPN)表达水平,分析其用于乳腺癌诊断的临床价值。方法应用RT-PCR法检测45例乳腺癌病灶及其癌旁组织的OPN表达水平,分析其与临床病理特征之间的关系;ELISA检测乳腺癌(45例)、乳腺良性肿瘤(19例)以及正常体检女性(26例)血清中的OPN的水平,同时免疫化学发光法检测其血清CA153的浓度,ROC曲线分析OPN、CA153以及二者联合检测对乳腺癌诊断的价值。结果 45例乳腺癌病灶和相应的癌旁组织中OPN mRNA阳性表达率为分别77.78%(35/45)和37.78%(17/45),乳腺癌组OPN mRNA表达量(1.51±0.16)显著高于癌旁组织(1.12±0.10),差异均具有统计学意义(P<0.05);OPN的表达与临床分期,病灶钙化以及腋窝淋巴结转移均具有相关性(P<0.05);与正常对照组和乳腺良性肿瘤组比较,乳腺癌血清中的OPN含量显著升高;Ⅲ期+Ⅳ期血清OPN浓度显著高于Ⅰ期+Ⅱ期(P<0.05);转移组的OPN含量明显高于未转移组,差异具有统计学意义(P<0.01);血清中的OPN浓度与组织中OPN mRNA表达水平显著相关(r=0.653,t=4.91,P<0.05);OPN、CA153及二者联合检测诊断乳腺癌的灵敏度分别为:73.3%、60.0%和95.6%,特异性分别为82.2%、91.1%和66.7%。结论 OPN在乳腺癌病灶组织中高表达,与乳腺癌临床分期,病灶钙化以及腋窝淋巴结转移相关;血清中OPN浓度与组织mRNA表达显著相关,可能是来源于组织中的骨桥蛋白的分泌;血清OPN可以作为乳腺癌转移诊断的辅助指标,联合CA153检测诊断性能明显优于单独检测,可明显提高灵敏度,对乳腺癌早期诊断具有重要意义。