含人AFP基因重组腺病毒载体的构建及其转染树突状细胞瘤苗的制备

目的：构建含人AFP基因的腺病毒载体,体外转染树突状细胞,制备树突状细胞肝癌瘤苗。方法：将AFP基因亚克隆到pIND载体和Shuttle2载体中,构建穿梭载体Shuttle2-AFP。用PI—SceⅠ和I—Ceu Ⅰ双酶切后将所获AFP基因片段再与线性化的腺病毒载体pAdeno—X连接,构成pAdeno—AFP重组腺病毒载体。其后,用重组腺病毒载体转染HEK293细胞,包装腺病毒表达载体。通过酶切、PCR对腺病毒载体进行鉴定。包装好的重组病毒载体pAdeno—AFP体外感染树突状细胞制备树突状细胞肝癌瘤苗后,FACS分析pAd-eno—AFP／DC表面分子的表达,酶联免疫吸附试验法（ELISA）检测AFP水平。结果：酶切、PCR鉴定证实,穿梭质粒插入片段为AFP基因。包装的腺病毒载体具有良好的感染性,可以在293细胞中形成病毒颗粒,腺病毒载体内携带AFP基因感染树突状细胞,pAdeno—AFP／DC能高水平的表达CD1a,CD11c,CD80,CD86以及HIA—DR,并分泌较高水平的AFP。结论：构建成功的含AFP腺病毒载体可以在树突状细胞中表达AFP,为DC瘤苗的进一步研究奠定了基础。     

干细胞动员时提前应用粒系集落刺激因子对患者发热及感染的影响

背景与目的：造血干细胞移植一直被广泛应用于恶性肿瘤和恶性血液系统疾病的治疗,甚至在一些良性疾患中也有应用,如再生障碍性贫血等。造血干细胞的动员也同样被广泛应用。由于移植过程中的高风险,任何能够增加造血干细胞的回收率和简化造血干细胞采集的方法都有望提高造血干细胞移植的成功率。因此本文研究旨在观察提前给予粒系集落刺激因子（在白细胞介于1×10^9-2×10^9/L时）,是否影响干细胞采集的数量和患者感染、发热的发生率。方法：对70例恶性肿瘤患者按随机单双号顺序进入A组和B组。全部患者给予环磷酰胺4 g/m2化疗,分别在白细胞≤1×10^9/L后（A组）和介于1×10^9-2×10^9/L（B组）时,皮下注射粒系集落刺激因子（惠尔血）5μg/kg。在白细胞回升至2×10^9/L以上时,分2-3次采集外周血造血干细胞,同时计数单个核细胞和CD34＋细胞数量。结果：A组采集单个核细胞数量平均为4.34×10^8/kg;B组为3.8×10^8/kg（P〉0.75）。CD34＋细胞A组为2.62×10^6/kg;B组为2.97×10^6/kg（P〉0.9）。感染、发热的发生率A组为18/33;B组为8/35（P〈0.01）。结论：提前给予粒系集落刺激因子（G-CSF）不会影响外周血造血干细胞采集的数量,而发热和感染的发生率却显著降低。     

变性高效液相色谱检测恶性肿瘤患者血浆DNA p53突变

目的 探讨扩增恶性肿瘤患者血浆DNA的可行性，建立一种快速检测血浆DNA突变的新方法。方法 选取恶性肿瘤患者共40例，采用Qiagen column柱抽提法提取血浆DNA，采用聚合酶链反应（PCR）扩增p53基因外显子7，用变性高效液相色谱法（DHPLC）对产物进行突变分析，并与测序结果比较。结果 40例恶性肿瘤患者血浆提取的DNA均能扩增出目的片断，DHPLC检测到有8例突变，随机送检的8份DHPLC未检测到突变者测序也未发现突变存在，与DNA直接测序结果相一致。结论 对恶性肿瘤患者血浆DNA行PCR扩增是可行的，DHPLC可作为一种快速，简便和经济的突变筛选方法，运用此方法检测血浆中p53等基因的突变有望应用于恶性肿瘤高危人群的预警和早期诊断以及作为预后参考。     

乳腺癌患者血浆线粒体D环高变区基因突变研究

目的:研究检测血浆线粒体DNA基因突变对于乳腺癌诊断的参考价值。方法:选取乳腺癌患者35例,健康 对照者10人,提取血浆DNA,设计两对引物,采用聚合酶链反应(PCR)扩增血浆线粒体DNA的D环HVR1和HVR2,然后用 变性高效液相色谱法(DHPLC)对产物进行突变筛选。结果:乳腺癌患者的血浆DNA扩增率(46/140)和筛选的突变率(5/46) 与对照组比较,差异具有显著性(P<0.05)。结论:检测血浆线粒体DNA基因突变可能对于乳腺癌的诊断具有重要意义。     

变性高效液相色谱检测乳腺癌患者血浆线粒体D环HVR2突变

目的 :探讨扩增乳腺癌患者血浆线粒体DNA(mito chondrialDNA ,mtDNA)的可行性 ,研究乳腺癌患者血浆线粒体DNA基因突变检测对于乳腺癌早期诊断及其预后的意义 .方法 :选取乳腺癌患者 10例 ,正常健康者 10人 ,提取血浆DNA ,采用聚合酶链反应 (PCR)扩增血浆线粒体DNA的D环HVR2 ,用两对引物扩增 ,用变性高效液相色谱法 (DHPLC)对产物进行突变筛选 .结果 :10例乳腺癌患者血浆提取的DNA能扩增出 11个目的片断 ,DHPLC检测到有 4例突变 ,正常健康者 10人扩增出 1例 .结论 :乳腺癌患者血浆DNA扩增与正常组有明显差异 (P <0 .0 5 ) ,血浆线粒体DNA基因突变检测对于乳腺癌早期诊断及预后有重要意义     

腺病毒介导的HBsAg基因修饰树突状细胞的体外生物学特性

目的： 〖HT5"SS〗探讨腺病毒介导乙型肝炎病毒表面抗原（AdVHBsAg）基因修饰树突状细胞（dendritic cell,DC）瘤苗体外生物学活性。〖HT5W〗方法〖HT5"SS〗：将腺病毒表达载体AdVHBsAg转染人单个核细胞来源的DC,构建AdVHBsAgDC肝癌瘤苗,采用Western blotting法鉴定转染基因表达,FACS检测表面分子和内吞功能,3HTdR法检测T细胞增殖反应的能力,MTT法检测CTL活性。〖HT5W〗结果〖HT5"SS〗：HBsAg基因转染后,Western blotting法检测结果示HBsAg基因表达于转染的DC,表明腺病毒介导的HBsAg基因转染的有效性。AdVHBsAgDC可高表达CD1a、CD11c、 CD83、CD86和HLADR,但内吞功能较DC组降低(P<0.05)。AdVHBsAg DC刺激自体T细胞增殖功能均明显高于DC对照组和AdVLacZDC组(P<0.05)。AdVHBsAg DC体外诱导CTL对HepG2215肿瘤细胞的杀伤作用具有特异性。〖HT5W〗结论〖HT5"SS〗：肝癌相关基因HBsAg可作为乙型肝炎病毒相关性肝癌的切入点,该研究为HBV相关肝癌DC体内免疫治疗提供了实验依据。     

含人AFP基因重组腺病毒载体的构建及其转染树突状细胞瘤苗的制备

目的:构建含人AFP基因的腺病毒载体,体外转染树突状细胞,制备树突状细胞肝癌瘤苗.方法: 将AFP基因亚克隆到pIND 载体和Shuttle2载体中,构建穿梭载体Shuttle2-AFP.用PI-Sce Ⅰ和I-CeuⅠ双酶切后将所获AFP基因片段再与线性化的腺病毒载体pAdeno-X连接,构成pAdeno-AFP重组腺病毒载体.其后,用重组腺病毒载体转染HEK293细胞,包装腺病毒表达载体.通过酶切、PCR对腺病毒载体进行鉴定.包装好的重组病毒载体pAdeno-AFP体外感染树突状细胞制备树突状细胞肝癌瘤苗后,FACS分析pAdeno-AFP/DC表面分子的表达,酶联免疫吸附试验法( ELISA) 检测AFP水平.结果: 酶切、PCR鉴定证实,穿梭质粒插入片段为AFP基因.包装的腺病毒载体具有良好的感染性,可以在293细胞中形成病毒颗粒,腺病毒载体内携带AFP基因感染树突状细胞,pAdeno-AFP/DC能高水平的表达CD1a,CD11c,CD80,CD86以及HLA-DR,并分泌较高水平的AFP.结论: 构建成功的含AFP腺病毒载体可以在树突状细胞中表达AFP,为DC瘤苗的进一步研究奠定了基础.     

IL-18基因增强肿瘤抗原致敏DC诱导的CTL特异性杀伤肝癌细胞

目的:探讨腺病毒介导的白细胞介素18(IL18）基因转染能否使肿瘤抗原冲击的树突状细胞(dentritic cell,DC) 在体外诱导出更强的抗肝癌免疫反应。方法：携IL18 的重组腺病毒载体感染经肝癌细胞株HepG2冻融抗原致敏的DC(AdIL18HepG2/DC), FACS分析AdIL18HepG2/DC表面分子的表达, ELISA法检测IL18的分泌水平, 3HTdR掺入法检测T淋巴细胞增殖能力, MTT法检测细胞毒性T 淋巴细胞杀伤效应。结果： AdIL18HepG2/DC较未转染DC能高水平地表达CD1a、CD11c、CD80、CD86以及HLADR;较未经IL18转染的DC分泌较高水平的IL18。AdIL18HepG2/DC 能非常有效地刺激自体T 细胞增殖(CPM 值为228 018±1 079),其刺激强度显著强于AdIL18DC、HepG2/DC、AdlzcZ/DC及DC（均P＜0.05）。当靶细胞为HepG2时,AdIL18HepG2/DC诱导的CTL杀伤活性显著高于其他各组（均P＜0.05）,并且其杀伤能力与效应细胞数量成正比。结论： IL18 基因转染且肝癌抗原致敏的DC可以显著增强DC的特异性抗肝癌效应。     

IL-18基因增强肿瘤抗原致敏DC诱导的CTL特异性杀伤肝癌细胞

目的: 探讨腺病毒介导的白细胞介素-18(IL-18)基因转染能否使肿瘤抗原冲击的树突状细胞(dentritic cell,DC) 在体外诱导出更强的抗肝癌免疫反应.方法:携IL-18 的重组腺病毒载体感染经肝癌细胞株HepG2冻融抗原致敏的DC(AdIL-18-HepG2/DC), FACS分析AdIL-18-HepG2/DC表面分子的表达, ELISA法检测IL-18的分泌水平, 3H-TdR掺入法检测T淋巴细胞增殖能力, MTT法检测细胞毒性T 淋巴细胞杀伤效应.结果:AdIL-18-HepG2/DC较未转染DC能高水平地表达CD1a、CD11c、CD80、CD86以及HLA-DR;较未经IL-18转染的DC分泌较高水平的IL-18.AdIL-18-HepG2/DC 能非常有效地刺激自体T 细胞增殖(CPM 值为228 018±1 079),其刺激强度显著强于AdIL-18DC、HepG2/DC、AdlzcZ/DC及DC(均P＜0.05).当靶细胞为HepG2时,AdIL-18-HepG2/DC诱导的CTL杀伤活性显著高于其他各组(均P＜0.05),并且其杀伤能力与效应细胞数量成正比.结论:IL-18 基因转染且肝癌抗原致敏的DC可以显著增强DC的特异性抗肝癌效应.     

腺病毒介导的HBsAg基因修饰树突状细胞瘤苗的制备

目的:构建含人HBsAg基因的腺病毒载体,体外转染树突状细胞,制备树突状细胞肝癌瘤苗。方法:将HBsAg基因亚克隆到pIND载体和Shuttle2载体中,构建穿梭载体Shuttle2-S。用PI-SceⅠ和I-CeuⅠ双酶切后将所获HBsAg基因片段再与线性化的腺病毒载体pAdeno-X连接,构成pAdeno-S重组腺病毒载体。其后,用重组腺病毒载体转染HEK293细胞,包装腺病毒表达载体。通过酶切、PCR对腺病毒载体进行鉴定。包装好的重组病毒载体pAdeno-S体外感染树突状细胞制备树突状细胞肝癌瘤苗后Westernblot法检测其表达,流式细胞仪检测其能否诱导树突状细胞凋亡。结果:酶切、PCR鉴定证实,穿梭质粒插入片段为HBsAg基因。包装的腺病毒载体具有良好的感染性,可以在293细胞中形成病毒颗粒,腺病毒载体内携带HBsAg基因感染树突状细胞,经Westernblot法鉴定证实能够表达转染基因,并且不会诱导树突状细胞凋亡。结论:构建成功的含HBsAg腺病毒载体可以在树突状细胞中表达HBsAg,为DC瘤苗的进一步研究奠定了基础。