实时荧光定量PCR法检测MTX对映体耐药A549细胞株及白血病患者骨髓细胞中FPGS mRNA的表达

目的 建立实时荧光定量PCR检测肿瘤细胞中FPGS mRNA表达的方法,研究MTX对映体[L-(+)-MTX和D-(-)-MTX]耐药细胞株中FPGS的基因表达差异,并用于观察白血病患者MTX治疗耐药前后FPGS mRNA表达水平的变化.方法 用SYBR Green Ⅰ为荧光染料,以β-actin作参照,建立检测FPGS mRNA的实时荧光定量PCR方法.根据Ct值、标准曲线相关系数、斜率、重复性曲线、熔解曲线、扩增效率曲线等进行方法学评价.并用该方法检测MTX对映体耐药细胞株及应用MTX耐药的14例白血病患者骨髓细胞中FPGS mRNA的表达.结果 建立的标准曲线Ct值与模板浓度有良好的线性关系,FPGS和β-actin标准曲线相关系数分别为0.996 8和0.998 7,斜率分别为-3.595和-3.740,批内CV为1.27%～2.95%,批间CV为3.82%;熔解曲线均呈单个特异峰,扩增效率相似(斜率为0.021 7);L-(+)-MTX耐药细胞和D-(-)-MTX耐药细胞中FPGS mRNA相对含量分别为(3.51±0.66)和(0.16±0.01),A549亲本细胞(S)中FPGS mRNA相对含量为(1.00±0.31),差异有统计学意义(F=64.45,P＜0.01);L-(+)-MTX耐药细胞和D-(-)-MTX耐药细胞间FPGS mRNA相对含量差异有统计学意义(q=9.29,P＜0.01).白血病患者应用MTX治疗耐药后,FPGS mRNA表达水平为(0.35±0.04),用药前为(1.00±0.44),差异有统计学意义(t=8.83,P＜0.01).结论 建立的实时荧光定量PCR检测FPGS mRNA的方法重复性好、特异度高,可用于FPGSmRNA含量分析.MTX诱导耐药后细胞株及白血病患者骨髓细胞中FPGS mRNA表达发生了变化,MTX 2种对映体形式在细胞耐药机制中可能发挥了不同的作用.     

一步法实时荧光RT-PCR在快速检测甲型流感病毒中的应用

目的建立一种能快速检测甲型流感病毒的一步法实时荧光PCR方法,对样本进行准确检测。方法以甲型流感病毒特异M基因的保守区为靶区域设计特异引物和TaqMan荧光探针,建立一步法实时荧光RT-PCR方法,并对乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒Long株、冠状病毒OC43及229E、副流感病毒1、2、3型以及季节性流感病毒H1、H3进行检测,验证该方法的特异性和灵敏度,并对临床样本进行检测应用。结果所建立的一步法实时荧光RT-PCR可对甲型流感病毒进行特异扩增,操作方便快速,对H1和H3亚型的最低检出限可达0.01TCID50/ml;对384例临床咽拭子样本的检测准确度达99.5%。结论本研究建立的一步法实时荧光RT-PCR方法可实现对甲型流感病毒快速准确的检测,有助于对临床流感病例的快速诊断。     

非小细胞肺癌患者hnRNPA2／B1检测的临床意义

目的本研究的目的是通过非小细胞肺癌肿瘤组织和外周血hnRNPA2／B1的检测探讨临床预后。方法采用实时荧光定量RT-PCR方法分别对30例NSCLC患者肿瘤组织和外周血及8例非恶性肿瘤患者的正常肺组织进行hnRNPA2／B1检测。随访一年后对无复发患者外周血hnRNPA2／B,复查。结果30例NSCLC患者经过一年随访复查,死亡和复发组的肿瘤组织hnRNPA2／B1与正常肺组织组和无瘤生存组比较有显著差异（P〈0．05）,而外周血在死亡和复发组与无瘤生存组间无差异（P〉0．05）,同样TNM临床分期之间也无差异（P〉0．05）。但一年后复查无瘤生存组外周血hnRNPA2／B1明显降低,与死亡和复发组以及无瘤生存组手术前的血hnRNPA2／B1比较有显著差异（P〈0．05）。结论NSCLC患者肿瘤组织的hnRNPA2／B1明显增高,显著增高预示预后极差,但外科手术治疗后预后好的患者外周血hnRNPA2／B1则明显降低,因此NSCLC患者的肿瘤组织和外周血hnRNPA2／B1检测可以用来指导术后的进一步治疗和判断预后。     

乙型肝炎病毒基因型的国内研究进展

乙型肝炎病毒基因型分布有地理差异,并与肝病的发生、发展,以及抗病毒药物的疗效,都有一定的相关性。对近年来国内乙型肝炎病毒基因型的有关研究作一综述。     

应用荧光定量PCR法联合检测NSCLC外周血有核细胞3p基因多区域LOH

目的探讨人3号染色体短臂(3p)等位基因位点杂合性缺失(LOH)多区域联合检测的意义。方法采用实时荧光定量PCR方法分别对32例非小细胞肺癌患者及8例非恶性肿瘤患者外周血有核细胞进行3p位点LOH检测,对试验结果统计学分析。结果32例非小细胞肺癌外周血有核细胞LOH联合检出率为65.625%,各目的基因检出率分别为18.75%(3p25)、31.25%(3p14)、50%(3p21.3),相比对照组检测结果差异具有显著性,联合检出率高于各位点单纯检出率,差别具有显著性。结论非小细胞肺癌外周血有核细胞3p位点LOH检测对于肺癌的无创诊断有意义,且多区域联合检测有助于提高检测的敏感性。     

非小细胞肺癌3p染色体多区域杂合性缺失检测的研究

背景与目的 已有研究表明,3号染色体短臂(3p)等位基因的杂合性缺失(loss of heterozygaity,LOH)是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)发生中常见且早期发生的分子生物学改变,可以造成该染色体所包含的多种抑癌基凶的失活.本研究的目的是探讨人3p LOH在非小细胞肺癌(NSCLC)临床检测中的意义.方法采用荧光定量PCB方法分别对32例非小细胞肺癌肿瘤组织及8例非恶性肿瘤肺组织和外周血有核细胞进行3p位点LOH检测,对试验结果进行非参数检验.结果 32例肺癌标本中LOH联合检出率为78.125%,外周血有核细胞LOH联合检出率为65.625%,其中肺癌组织标本各位点LOH检出率分别为43.75%(3p25)、56.25%(3p14)、56.25%(3p21.3),外周血有核细胞检出率分别为18.75%、31.25%、50%,相比对照组结果具有差异,组织及外周血有核细胞联合榆出率高于各位点单纯检出率,差别具有统计学意义;同一患者的肺癌肿瘤组织与外周血有核细胞3p基因LOH联合检测结果存在一致性.结论 肺癌组织及外周血有核细胞3p基因LOH检测对于肺癌的无创诊断具有较好的临床意义,且多位点联合榆测有助于提高检测的敏感性.     

氨甲蝶呤对映体耐药A549细胞的表皮生长因子受体基因表达及迁移能力

目的研究氨甲蝶呤(MTX)对映体耐药人非小细胞肺癌A549细胞的迁移能力以及表皮生长因子受体(EGFR)mRNA的表达。方法用细胞划痕试验检测L-(+)-MTX/A549细胞和D-(-)-MTX/A549细胞的迁移能力;双层软琼脂克隆试验检测L-(+)-MTX/A549细胞和D-(-)-MTX/A549细胞的克隆形成率并观察集落的形态;用RT-PCR检测亲本A549细胞、L-(+)-MTX/A549细胞和D-(-)-MTX/A549细胞中EGFR mRNA的表达。结果加入MTX 72 h后D-(-)-MTX/A549细胞的迁移能力(1 230.1±40.2)高于L-(+)-MTX/A549细胞(530.3±25.4);D-(-)-MTX/A549细胞、L-(+)-MTX/A549细胞和亲本A549细胞的克隆形成率(%)分别为(1.38±0.17)、(1.36±0.13)和(1.37±0.15),差异无统计学意义(P>0.05);亲本A549细胞、L-(+)-MTX/A549细胞均有EGFR mRNA表达,其光密度值(IDV)分别为(6 630±64)、(3 697±27),差异有统计学意义(t=103.42,P<0.01)。而D-(-)-MTX/A549细胞不表达EGFR。结论 D-(-)-MTX诱导的A549细胞的迁移能力大于L-(+)-MTX。EGFR基因表达具有手性差异。     

实时荧光定量聚合酶链反应动态监测慢性粒细胞白血病治疗后微小残留病的研究

 【摘要】 目的 建立慢性粒细胞白血病（CML）实时荧光定量聚合酶链反应（RQ-PCR）检测方法,并研究应用此方法检测CML治疗后微小残留病（MRD）对评价MRD的意义。方法 应用RQ-PCR对80例CML患者初诊时和（或）治疗后的骨髓标本进行分析,检测bcr-abl融合基因的转录水平,回顾性分析临床资料,根据治疗方案不同分为异基因造血干细胞移植组（34例）、甲磺酸伊马替尼组（33例）、羟基脲组（13例）为,监测CML患者治疗前后bcr-abl融合基因变化。结果　RQ-PCR检测初诊CML患者bcr-abl阳性平均值为6847.67拷贝／万个细胞,加速期检测平均值为306 176.08拷贝／万个细胞;异基因造血干细胞移植组移植后1个月检测平均值为944.33拷贝／万个细胞,移植后6个月复测平均值2.37拷贝／万个细胞,移植后12个月复测平均值0.29拷贝／万个细胞,移植后24个月检测不到bcr-abl融合基因;甲磺酸伊马替尼组服用3个月后检测平均值3720.23拷贝／万个细胞,服用12个月＜0.10拷贝／万个细胞;羟基脲组用药0个月平均值7290.11拷贝／万个细胞,服用9个月后检测平均值3143.24拷贝／万个细胞。基因造血干细胞移植组、甲磺酸伊马替尼组相同时间bcr-abl水平差异无统计学意义（t＝1.74,P＝0.17）,羟基脲组与前两组间比较差异有统计学意义（t＝3.74.P＝0.01;t＝2.97,P＝0.02）。疾病进展时可检测到bcr-abl转录水平的上升;加速期患者的转录本水平明显高于慢性期患者。结论 RQ-PCR作为CML治疗后MRD检测的方法,可以评价治疗效果,预测疾病复发,早期给予干预治疗,有重要临床应用价值。     

FQ—PCR检测HPV基因型的临床应用分析

目的了解人乳头瘤病毒感染患者HPV6,11型和HPV16,18型的分布。探讨HPV—DNA分型检测的临床应用价值。方法采用荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）方法检测1567例HPV感染者疣体组织或分泌物中的HPV6,11型和HPV16,18型。结果男女性均可感染HPV6,11和HPV16,18型,男性感染者以HPV6,11型为主,感染率为27．68％（157／567）。女性1000人次中,确诊感染HPV有659人,HPV阳性320人次,检出率为32％,其中低危型208例,即HPV6,11型阳性率为31．56％;高危型112例,即HPVl6,18型为16．99％。结论FQ—PCR具有灵敏度高、特异性强、简捷方便的特点,适于临床推广应用。HPVDNA分型检测技术可以快速区分高危型及低危型HPV感染,有助于对尖锐湿疣的复发和宫颈癌变作出可能性预测。