人牙本质涎蛋白在COS-7细胞中的表达

目的 :构建人牙本质涎蛋白 (humandentinsialoprotein ,hDSP)真核表达载体 ,用瞬时系统表达目的基因。方法 :将hDSP全长基因定向克隆入真核表达质粒载体pcDNA3 ,构建pcDNA3 hDSP重组质粒 ,脂质体转染法转染COS 7细胞 ,48～ 72h收集细胞及培养上清 ,Westernblot和免疫组化检测表达产物。结果 :酶切鉴定表明重组表达载体构建成功 ;Westernblot检测显示在 60 0 0 0处出现一条清晰的特异性免疫阳性条带 ;免疫组化染色显示细胞胞质内有大量棕黄色颗粒 ,进一步证明该转染方法可行 ,转染效率较高。结论 :hDSP全长基因可以在COS 7细胞获得瞬时高效表达。     

从人软骨提取总RNA和CDMP－1成熟肽片段的克隆

目的 克隆人软骨来源形态发生蛋白－１（ＣＤＭＰ－１）成熟肽编码区的基因片段。方法 用异流氰酸胍一步法从人软骨组织和酶消化法原代培养的软骨细胞中分别抽提总ＲＮＡ,利用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出人ＣＤＭＰ－１成熟区的基因片段（约１．０ｋｂｐ）,将所得基因片段插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）质粒载体,重组质粒ＤＮＡ,通过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果 从罗骨组织直接取到总ＲＮＡ,其质量与从等重量软骨     

皮肤来源的前体细胞培养和向神经元分化的观察

目的　研究皮肤来源的前体细胞 (SKPs)的体外培养方法 ,为神经移植提供一种新的细胞来源。方法　分离培养小鼠皮肤组织的细胞 ,在无血清的培养基中培养 ,用机械方法对细胞进行传代 ,免疫细胞化学方法对细胞进行鉴定。结果　从成年和幼年的小鼠皮肤组织中分离培养出SKPs ,这种细胞在体外可以长期增殖和传代 ,体外培养可超过 8代 ,这种细胞大部分表达纤维粘连蛋白 ,约50 %的细胞表达巢蛋白。在有血清的培养基中培养 ,约 5%的细胞分化为神经元样细胞 ,表达神经元特异性烯醇化酶和神经微丝 ,部分细胞分化为脂肪细胞 ,其余的细胞分化为成纤维细胞样细胞。结论　皮肤组织中存在的前体细胞可在体外稳定增殖 ,能够分化为神经细胞、脂肪细胞和成纤维细胞样细胞。这种前体细胞有潜力成为神经移植的一种细胞来源     

Angiostatin的分离纯化及对B16黑色素瘤的抑制作用

目的:研究Angiostatin对黑色素瘤的治疗作用.方法:从人血浆组分Ⅲ中用亲和层析的方法分离Plasminogen和通过离子交换层析和分子筛技术得到弹性蛋白酶纯品.经此酶分离Plasminogen进行有限酶解,产物经亲和层析分离得到Angio-statin.结果:体外实验表明,Angiostatin能显著抑制牛主动脉弓内皮细胞的增殖.体内实验发现,以0.6 mg/kg·d的剂量腹腔注射14d后,B16黑色素瘤生长抑制率达77%(P<0.05);以小鼠尾静脉注射的方法建立黑色素瘤转移模型,采用同样的方法冶疗18d后,B16黑色素瘤的肺转移率降低了65%(P<0.05).结论:本研究为Angiostatin用于黑色素瘤的治疗提供了实验依据,说明Angiostin在肿瘤治疗方面有着广泛的应用前景.     

表达Angiostatin基因的B16黑色素瘤体内抑制作用

目的:研究表达Angiostatin基因的B16黑色素瘤的体内生长行为.方法:通过改造Plasminogen cDNA得到Angiostatin基因,构建成真核表达载体pAGAGS3后导入B16黑色素瘤细胞使其表达.结果:表达Angiostatin的B16黑色素瘤细胞体外生长速率和软琼脂中克隆形成能力均未改变.但接种小鼠26d后,体内生长抑制率达87%(P<0.01).结论:表达Angiostatin的B16黑色素瘤体内生长受到显著抑制.     

生长激素促分泌素受体基因敲除小鼠胚胎干细胞的建立

目的建立生长激素促分泌素受体（ghrelin receptor，GHS-R）基因敲除小鼠胚胎干细胞（ES细胞）杂合子模型，为研究GHS—R基因的功能奠定基础。方法用TK-neo置换原X-pPNT载体的PGK—neo构建目标载体。以小鼠基因组DNA为模板，用PCR方法扩增2条同源臂，将其按照一定方向装入含有TK—neo的X—pPNT载体，并测序鉴定。载体线性化及纯化后电穿孔转染小鼠ES细胞，用G418和更昔洛韦（Gancyclovir）对电穿孔转染后的ES细胞进行正、负筛选培养，得到双药抗性ES细胞，克隆后抽提基因组DNA，分别用PCR方法鉴定2条同源臂，并测序确定成功同源重组的ES细胞克隆。结果改建X—pPNT载体成功，PCR获得2条同源臂片段，测序正确，并按一定方向装入打靶载体，ES细胞转染后经双药筛选得到328个阳性ES细胞克隆，PCR及测序鉴定证实3个克隆发生同源重组。结论本研究成功获得了GHS-R（-／＋）杂合子小鼠ES细胞克隆，为进一步通过显微注射及杂交育种获得GHS—R基因敲除小鼠打下了基础。     

帕金森病患者血淋巴细胞多巴胺转运蛋白功能与密度的研究

目的：研究帕金森病(PD)患多巴胺转运蛋白(DAT)功能与密度的变化及其在：PD早期诊断中的意义。方法：实验对象分为PD组、正常老年对照组和脑血管病组。用放射性核素方法测定3组患的血淋巴细胞对^3H-多巴胺(DA)和^3H-WIN35428的放射性摄取率。结果：PD组的外周血淋巴细胞对^3H-DA和^3H-WIN35428的放射性摄取率低于脑血管病组和正常老年对照组；左旋多巴治疗的PD患外周血淋巴细胞对^3H-DA的放射性摄取率高于未治疗的PD患．对^3H-WIN35428的放射性摄取率两差异无显性。DA受体激动剂治疗的：PD患外周血淋巴细胞对^3H-DA和^3H-WIN35428的放射性摄取率均无影响。结论：PD患血淋巴细胞DAT的功能与密度明显降低，有可能作为疾病早期诊断的生物学指标。左旋多巴治疗对DAT的功能有促进作用但对其密度无影响；DA受体激动剂对DAT的功能和密度均无影响。     

体外培养人类神经干细胞神经球中髓鞘的形成

目的：探索人类神经干细胞的体外培养条件和其形成的神经球的超微结构。方法：从胎脑皮质中机械分离细胞，N2培养基培养和扩增人类神经干细胞，应用免疫细胞化学方法对培养的细胞进行鉴定。对形成的神经球应用透射电镜进行超微结构研究。结果：从胎儿的脑皮质中成功分离培养出神经干细胞，形成典型的神经球，大部分细胞表达神经干细胞的标志物波形蛋白，细胞贴壁后可诱导分化 为神经元和胶质。早期培养的神经球中有典型的髓鞘形成。结论：从胎儿的脑皮质中成功地分离、培养出人类的神经干细胞，细胞呈悬浮状态生长，形成神经球。这种早期培养的神经干细胞有形成髓鞘的能力，可作为治疗人类脱髓鞘病变的潜在细胞来源。     

人卵巢癌细胞C－erbB－2扩增及表达抑制TNF和LAK杀伤活性的实验研究

利用人卵巢癌细胞株，在确定Ｃ－ｅｒｂＢ－２扩增和过表达及Ｃ－ｅｒｂＢ２正常拷贝和低表达的基础上对Ｃ－ｅｒｂＢ－２扩增及表达与ＴＮＦ和ＬＡＫ杀伤活性的关系进行研究，并以非特异性杀伤物Ｈ２Ｏ２为对照。结果表明：Ｃ－ｅｒｂＢ－２扩增及过表达可明显抑制ＴＮＦ和ＬＡＫ的杀伤活性（Ｐ＜０．０５），但对Ｈ２Ｏ２的杀伤活性无显著影响。提示临床上部分卵巢癌患者用ＴＮＦ和ＬＡＫ治疗的疗效低或无反应性与Ｃ－ｅｒｂＢ－２的扩增及过表达有关。     

人胃动素受体基因表达载体的构建

目的 构建人胃动素受体基因的原核表达载体。方法 通过巢式PCR扩增人基因组DNA，获得人胃动素受体基因的658bp的靶片段，将其粘端克隆，然后应用限制性酶切、半巢式PCR扩增及测序鉴定。结果 成功克隆了人胃动素受体基因表达片段，测序证实读框正确。结论 人胃动素受体表达片段获得成功克隆。