从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位

目的：建立一种有效从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位HspA的方法。方法：重组基因工程大肠杆菌发酵后，表达的Hp r HspA包涵体经洗涤，变性，复性，采用Q Sepharose High Performance阴离子交换层析和Superdex75凝胶过滤层析分离纯化，使用SDS－PAGE和HPLC检测纯度，选用ELISA和动物实验对纯化蛋白的免疫学活性和生物学活性进行鉴定。结果：Hp的HspA包涵经洗涤和溶解后，Hp的HspA的纯度＞60％，包涵体溶解液经阴离子交换层析和凝胶过滤层析后纯度超过95％，Hp的HspA纯品经检测具有良好的免疫学活性和生物学活性。结论：本研究建立的分离纯化方法可从包涵体中获得高纯度的重组HspA蛋白，为进一步的动物实验研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位核酸疫苗的发酵、纯化及鉴定

目的 大规模发酵、纯化幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(ureB)基因疫苗，并对纯化后的疫苗进行鉴定。方法 大规模发酵DH5α(pT-ureB)，收获的细菌经碱裂解后，用两步离子交换层析方法分离、纯化疫苗，通过紫外分光光度计、酶切、体外转染等对疫苗进行鉴定。结果 发酵幽门螺杆菌ureB核酸疫苗，并经离子交换层析方法纯化获得了高质量的疫苗。结论 纯化的ureBDNA疫苗为进一步的免疫实验奠定了基础。     

三种LT突变体的幽门螺杆菌疫苗黏膜免疫佐剂效应比较

目的 探讨3种大肠杆菌不耐热肠毒素突变体在辅佐幽门螺杆菌候选疫苗尿素酶B亚单位(rUreB)中的佐剂效应.方法 各组Balb/c小鼠分别用PBS、rUreB、rUreB LTK63、rUreB LTR72、rUreB LTKR及rUreB CT进行4次口服免疫.ELISA检测胃、肠、气管冲洗液sIgA以及血清IgG亚类(IgG1,IgGa);RT-PCR差异显示T淋巴细胞IFN-γ、IL-4 mRNA;ELISPOT检测肠派伊尔氏结IgA、IgG抗体分泌细胞.结果 ①各rUREB加突变体佐剂组在胃、肠、气管的sIgA和血清IgG1、IgG2a水平显著高于PBS组和单独rUreB组(P＜0.01);②抗原刺激后取自各rUreB加突变体佐剂组T淋巴细胞表达的IFN-γ、IL-4 mRNA显著高于PBS组和rUreB组(P＜0.01);③各rUreB加突变体佐剂组小肠派伊尔氏结抗体分泌细胞数都显著高于PBS组和单独rUreB组(P＜0.01).结论 3种突变体都能辅佐rUreB在小鼠上产生特异的抗rUreB的抗体,且3种突变体诱导的免疫应答可能都是Th1/Th2型.LTR72的佐剂效应强于LTK63及LTKR.LTKR无毒,其稳定性高于LTR72,佐剂活性高于LTK63,是一个有希望的新型黏膜免疫佐剂.     

幽门螺杆菌疫苗免疫机制的研究进展

幽门螺杆菌(H.pylori)是定植于人体胃粘膜的重要致病菌,而粘膜疫苗以其有效的保护性免疫成为防治H.pyiori的热点,但对相应的免疫机制的认识目前尚不明确.故本文对H.pyiori疫苗的保护性免疫机制中的抗原递呈机制,抗体的作用以及TH细胞反应的作用等研究进展做一概要介绍.     

抗重组志贺样毒素ⅡA亚单位单链抗体的构建及表达

目的 构建重组志贺样毒素ⅡA亚单位（SLT2A）单链抗体基因（scFv），并在大肠杆菌中进行分泌表达。方法 通过连接肽（Gly4Ser），将已成功扩增的抗SLT2A单克隆抗体（mAb）5F3的VL和Va连接成scFv基因VH-Linker-VL并在Va基因5′端和VL基因3′端引入Sfi Ⅰ和Not Ⅰ的酶切位点，克隆至经改造的分泌性表达载体pCANTAB6His中，转化Ecoli HB2151，IPTG诱导表达。表达产物经亲和层析纯化后，SDS-PAGE和Westem blot分析鉴定。结果 经限制性酶切鉴定及DNA测序分析证实，基因构建正确。SDS-PAGE和Westem blot分析表明scFv基因在大肠杆菌中得到表达，表达产物的相对分子质量为27000，与理论预期值相符，且可与相应抗原特异结合。结论 成功地实现了抗SLT2A scFv基因的原核分泌表达，为探讨0157菌感染的机制及防治研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌表位疫苗的设计、构建、表达及其免疫原性研究

目的 设计幽门螺杆菌（Hp）的表位疫苗并对其免疫原性进行研究。方法 将Hp的尿素酶B亚单位的三个Th表位及一个B细胞表位串联，表位之间用两个赖氨酸（KK）间隔，合成全基因，克隆到pET-22b载体上，在大肠杆菌B121（DE3）中表达；表达的重组蛋白经鉴定纯化后皮下免疫Balb／c小鼠，检测细胞免疫应答及体液免疫应答。结果 克隆表达的重组表位疫苗蛋白纯化后纯度达到95％，经N端测序证实为设计的表位疫苗蛋白，Th表位多肽（U546-561、U229-244、U237-251）、表位疫苗蛋白及rUreB均能够刺激表位疫苗致敏的小鼠淋巴细胞增殖（SI〉2），并且此疫苗能够刺激机体产生特异性抗体。结论 本研究中表位疫苗的设计方法能够使疫苗中包含的四个表位均发挥功能，并且具有较强的免疫原性，为研究Hp预防性和治疗性疫苗提供实验基础。     

表达肠出血性大肠杆菌 O157:H7 EspA 抗原的减毒沙门氏菌株的构建

目的 利用平衡致死系统构建表达O157:H7 EspA 的减毒鼠伤寒沙门氏菌.方法 构建表达EspA的重组质粒,再将其转入终宿主菌减毒鼠伤寒沙门氏菌x4550 株中构建成口服活疫苗株,用IPTG进行诱导表达,经聚丙烯酰胺凝胶电泳、Westen-blot检测EspA蛋白的表达情况.并观察重组菌体外培养的稳定性.结果 利用宿主-载体平衡致死系统构建了表达O157:H7 EspA的重组减毒沙门氏菌,经Tricine-SDS-PAGE电泳出现了1条Mr约21 000的蛋白条带,Westen-blot检测能与抗EspA的单克隆抗体发生特异性反应.且在没有选择压力的条件下体外能稳定地繁殖、生长和传代.结论 表达O157:H7 EspA的重组减毒沙门氏菌构建成功,为发展口服抗EHEC O157:H7的疫苗奠定了初步基础.     

幽门螺杆菌UreB单克隆抗体的制备及尿素酶活性抑制能力的研究

目的制备抗幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)单克隆抗体,并检测其对尿素酶活性的抑制能力。方法以重组UreB蛋白为免疫原,通过杂交瘤技术制备抗UreB单克隆抗体,用ELISA检测mAb的效价、亲和常数;用Westernblot检测mAb的特异性。将尿素酶与单克隆抗体预孵育后加入含有尿素和酚红的缓冲液,于550nm测定单克隆抗体对尿素酶活性的抑制能力。结果得到5株稳定分泌抗UreB的单克隆抗体的杂交瘤细胞1D5、9E1、3A2、1D6、6E6。测定抗体亚型1D5,9E1,3A2为IgG1,1D6、6E6为IgG2a,亲和常数分别为4×108、4.6×108、2.8×108、2×109、3×109L/mol。Westernblot鉴定5种单克隆抗体均能和重组UreB及全菌蛋白中的UreB抗原发生特异性结合,且均不与肠道常见菌发生交叉反应。5株单克隆抗体中只有6E6具有对尿素酶活性的抑制作用,且抑制率与单克隆抗体剂量相关。结论制备了5株稳定分泌抗UreB抗体的杂交瘤细胞株,产生的单克隆抗体效价高且特异性好,其中6E6能抑制尿素酶活性。本研究为探讨尿素酶的作用机制、UreB的纯化及Hp的临床诊断和治疗奠定了基础。     

幽门螺杆菌粘附素的研究进展

幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,Hp)是一种参与多种胃、十二指肠疾病的重要人类病原体 ,可引起慢性胃炎和消化性溃疡 ,并与胃癌密切相关 ,对人类健康构成严重危害。Hp在全世界人群中的慢性感染率达到 5 0 %以上 ,中国人群约有 6亿人口受累于Hp感染 ,大大超过乙肝病毒携带者人数。Hp感染最基本的条件之一是粘附定居 ,其定居因素包括动力、尿素酶和粘附素等。组织学研究表明 ,在胃内Hp只见于胃上皮细胞 ,一般大量存在于胃窦部 ,在胃内定植是Hp致病的前提 ,而粘附则是定植的关键〔1,2〕。Hp之所以能够在胃蠕动时不与食物一起被驱除的原因…     

临床免疫学及免疫检验开放式实验教学方法研究

为了适应21世纪发展需要,就围绕如何培养学生实践能力及科学素养,提高学生的综合素质,对检验医学专业的临床免疫学及免疫学检验实验教学进行探索.通过开放式实验教学培养学生综合思维、创新能力.