结核分枝杆菌Ag85B基因疫苗免疫保护作用的初步研究

目的:研究编码结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的基因疫苗pTB30m和pTB30s对免疫动物的保护作用。方法:以基因疫苗pTB30m和pTB30s肌注免疫BALB/c小鼠。免疫完成6 wk后,用5×105 CFU的MTB H37Rv毒株经小鼠尾静脉攻击感染。同时用尼龙毛柱分离基因免疫BALB/c小鼠的T细胞,并以5×106 T细胞/只小鼠过继免疫正常BALB/c小鼠,立即用105 CFU的MTB毒株经小鼠尾静脉攻击感染。4 wk后分别计数脾脏中的细菌负荷。结果:与生理盐水对照组相比较,pTB30m及pTB30s质粒免疫组BALB/c小鼠脾脏中的细菌负荷均减少,分别为0.645(log10 CFU,P<0.01)和0.839(log10CFU,P<0.001);而空质粒对照组小鼠脾脏中的细菌负荷减少较少。经质粒pTB30m和pTB30s免疫的BALB/c小鼠的T细胞,过继免疫的正常BALB/c小鼠,对攻击感染的MTB H37Rv毒株在脾脏中的增殖具有部分抑制作用。结论:pTB30s免疫的BALB/c小鼠,对MTB H37 Rv毒株攻击的保护作用优于pTB30m质粒免疫,有望进一步用于结核病的防治研究。     

人溶菌酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的：利用巴斯德华赤（Pichia pastoris）酵母真核表达系统,构建真核表达载体pPIC9K与人溶菌酶基因（humanlysozyme,hLY）的重组质粒pPIC9K-hLY,表达出具有活性的人溶菌酶。方法：此项研究在本实验室构建的人溶菌酶（hLY）基因与pUC19的重组质粒pUC19-hLY的基础上,通过设计一对引物,用多聚酶链式反应（PCR）扩增出人溶菌酶全基因片段后,将其克隆到巴斯德毕赤酶母分泌型表达载体pPIC9K中,构建重建质粒pPIC9K-hLY,经Bg1Ⅱ酶切线性化后,用电穿孔法将其转入毕赤酵母细胞内。通过G418筛选,选到的高拷贝转化子经PCR检测人溶菌基因与毕赤酵母染色体是否稳定整合,阳性克隆经甲醇诱导进行表达。结果：序列测定,经PCR扩增后的人溶菌酶基因与献发表的序列相比,缺失4个碱基。我们决定采用重组PCR法予以纠正,经序列测定结果正确。用PCR检测,人溶菌酶基因与毕赤酵母染色体稳定整合。用甲醇诱导表达并以SDS－PAGE分析,在Mr为15000左右出现一条蛋白带,表达量约占上清总蛋白的0．47。Western Blot证实表达产物具有天然人溶菌酶的抗原性。用黄色小球菌平板溶圈法鉴定表态产物具有人溶菌酶的活性。结论：成功的构建了重组质粒pPIC9K-hLY并在毕赤醇母中表达了人溶酶基因。     

基于“重大新药创制”国家科技重大专项的管理沟通体系的建立

沟通是项目管理成败的关键,是项目管理的核心工作之一。借国家科技重大专项启动实施之机,从项目承担单位的视角,基于“重大新药创制”科技重大专项的复杂性特点,在多项目并行及树型管理模式下,初步构建了项目管理沟通体系框架,分析了管理沟通过程中的几个关键问题,并就保证沟通体系高效运转提出了建议,为“重大新药创制”科技重大专项的规范管理提供参考。     

人细胞周期相关激酶(CCRK)启动子的分析和特征研究

目的：分析人CCRK基因启动子、启动子的核心序列及与其表达相关的转录因子。方法：采用5’-RACE技术鉴定人CCRK基因的转录起始点；对启动子区3’端3个截短片段255bp(-367／-128)，210bp(-322／-128)和160bp(-272／-128)进行删除分析，双荧光素酶分析测出的最小活性片段作为核心启动子的上游位点。通过生物软件Matlnspector V2．2分析核心启动子区域，寻找并推测重要的转录因子，并对其核心序列进行定点突变分析，再通过电泳迁移率(EMSA)实验加以鉴定。结果：采用5‘-RACE技术，得到的PCR产物直接测序，定位-242“T”为转录起始点；通过启动子3’端小片段删除分析，255，210和160bp均无活性，由此判断3’端255个核苷酸不存在核心启动子序列，并定位一段74bp的区域为核心启动子(-441／-367)区域。通过Matlnspector软件分析，发现在这段核心启动子区域内有3个重要的结合位点：Delta EF-1，NF-κB和Spl。对这3个结合位点的核心序列进行定点突变后瞬时转染U373，经双荧光素酶分析发现Delta EF-1的活性明显升高，NF-κB没有变化，Spl的活性降低但不太明显。进一步通过电泳迁移率(EMSA)实验鉴定，Delta EF-1和NF-κKB能与U373核蛋白形成特异性的DNA-蛋白质复合体，表明Delta EF-1和NF-κB两个转录因子与人CCRK基因表达相关。结论：对人CCRK启动子的特性研究，为今后认识该基因的转录调控机制打下了基础，为揭示恶性神经胶质瘤的发生机制及防治措施的研究提供了新的思路。     

改良消减杂交法筛选结核分枝杆菌毒力相关基因

0　引言　结核病是长期危害人类健康的严重疾患之一 ,目前我国每年死于结核病的人数达 2 5 .6万 ,在传染病中居第一位 .然而结核分枝杆菌的致病详细机制至今仍不清楚 ,给结核病的治疗和预防带来一定困难 .人型结核分枝杆菌毒株H37Rv是引起结核病的主要病原 ,其基因突变株 H37Ra丢失致病能力 .利用改良消减杂交技术筛选出 H37Rv株与H37Ra株之间的差异基因片段 ,为进行毒力基因研究提供了基础 .1　材料和方法1.1　 m RNA提取　结核分枝杆菌经溶菌酶和蛋白酶 K处理后 [1 ] ,采用 Promega Poly ATtract○RSystem10 0 0试剂盒分别提取毒…     

加强科研项目管理促进医学科研工作

目前，由于科研课题计划门类越来越多，管理层次越来越复杂，课题也越分越细，科研活动与经济社会的联系也越来越频繁，导致科研人员在主观上重视申请课题，轻视完成课题。为了保障科研项目的顺利进行和圆满完成，提高单位的信誉度，应该将先进的管理方法和管理理念运用到科研项目管理中去。通过提高科研项目管理水平，加强科研项目管理力度，及时发现项目进行过程中出现或存在的问题，提出相应的对策并拿出合理的解决办法。