含人基质金属蛋白酶组织抑制因子-1重组腺病毒的构建与体外表达

从人肝癌组织中提取总RNA，RT—PCR合成hTIMP-1的全长cDNA，克隆到腺病毒载体AdEasy系统的穿梭质粒pAdTraek—CMV上，与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183受体菌中进行同源重组，成功构建含hTIMP-1全长eDNA的重组腺病毒载体，经293细胞的包装、扩增，生成含hTIMP-1基因的重组腺病毒AdhTIMP-1并实现体外表达，为进一步研究肝癌浸润和转移机理以及肝癌的基因治疗提供实验基础。     

细胞自噬与幽门螺杆菌感染

幽门螺杆菌是一种广泛定植于人胃黏膜的革兰阴性菌,它通过逃逸机体局部免疫杀灭而持续感染,最终导致胃上皮损伤,与多种胃部疾病相关.自噬是进化过程中保留的细胞机制,既能清除胞质内容物,又不影响细胞的生存.幽门螺杆菌能够入侵胃上皮细胞和某些免疫细胞,诱导自噬的发生,并在自噬体中自我复制后被清除,推测自噬可能在幽门螺杆菌感染中扮...     

新生大鼠海马神经元体外氧-糖剥夺再灌注模型的建立

目的体外培养新生大鼠海马神经元,建立神经元氧-糖剥夺再灌注(OGD/R)模型,为临床进一步研究新生儿缺氧缺血性脑损伤奠定基础。 方法以L-多聚赖氨酸和鼠尾胶原作为海马神经元体外培养的生长基质,分离24 h内新生SD大鼠海马,胰蛋白酶水浴振荡消化获得单个细胞,采用Neurobasal维持培养基更继续培养。培养7 d后将神经元细胞培养基更换为无糖缺血液,置于95%高纯度氮气(N₂)三气培养箱内缺氧处理2 h。将其取出更换为正常培养基继续培养24 h,构建神经元OGD/R模型。然后,采用抗微管相关蛋白2-5-异硫氰酸荧光素(anti-MAP2-FITC)标记神经元,于荧光显微镜下观察建模前与建模后神经元的形态学改变,采用细胞活性检测试剂盒(CCK-8)检测微管相关蛋白(MAP)2阳性细胞存活率,对OGD/R模型进行评价。 结果荧光显微镜下观察到正常情况下神经元细胞形态结构完整,树突及轴突舒展,交织成网状。建模后,神经元突触回缩,细胞崩解,网状结构被破坏。CCK-8检测结果显示,建模后神经元细胞存活率降低。 结论此方法体外培养神经元细胞纯度在95%以上;使用无糖神经元细胞缺血液联合高纯度N₂培养2 h,再更换为正常培养基培养的方法,可成功建立神经元细胞的OGD/R模型。     

血管紧张素原基因单倍型与原发性高血压的关联研究

目的 研究中国人血管紧张素原（angiotensinogen,AGT)基因多态性及单倍型与原发性高血压的关系。方法 在335例高血压患者与196名血压正常人中采用PCR－限制性酶切片段长度多态性法检测血管紧张素原基因的多态性，同时用最大期望值方法进行两位点连锁不平衡和三位点的单倍型分析。结果 在M235T和A－20C，M235T和A－6G，A－20C和A－6G位点观察到了连锁不平衡（P＜10^-4)。病例－对照检验显示T235等位基因频率在高血压组中高于对照组，但所有单倍型频率分布在高血压组和正常对照组间差异无显著性。结论 受检人群中AGT基因各单倍型与高血压未见关联，但AGT基因T235位点可能是一种重要的高血压风险因子。     

端粒酶激活对缺氧缺血大鼠神经干细胞生物学行为的影响

目的探索神经干细胞端粒酶激活后,在缺氧缺血条件下其增殖与存活能力的变化。方法将传代培养神经干细胞分为对照组、氧糖剥夺(OGD)组、OGD+高浓度环黄芪醇(CAG)组和OGD+低浓度CAG组。高、低浓度CAG组分别加入终浓度为25μM和10μM的CAG;除对照组外,其余各组进行OGD处理。Western blot检测细胞端粒酶逆转录酶(TERT)表达水平;TRAP法检测端粒酶活性;显微镜下计数细胞数目、测量神经球直径;化学发光法检测乳酸脱氢酶(LDH)活性;流式细胞术检测细胞增殖和凋亡情况。结果与对照组相比,OGD处理后,神经干细胞数目减少,神经球直径缩小,凋亡细胞增多,细胞增殖率下降,存活率下降(P0.05);CAG作用后,神经干细胞TERT表达和端粒酶活性较对照组显著升高(P0.05);与OGD组比较,CAG作用后神经干细胞减少和神经球直径缩小程度明显减轻(P0.05),细胞增殖率升高,存活率升高(P0.05);不同浓度CAG作用效果无明显差异(P0.05)。在正常培养的神经干细胞中,与对照组相比,CAG作用能够提高神经干细胞TERT表达水平(P0.05),促进细胞数目增加和神经球直径增大(P0.05)。结论缺氧缺血状态下,端粒酶激活能够显著促进神经干细胞的增殖与存活,CAG有望用于缺氧缺血后脑损伤的修复与治疗。     

卵磷脂胆固醇酰基转移酶基因单核苷酸多态性与冠心病脂代谢易感性的关联研究

目的：检测卵磷脂胆固醇酰基转移酶（lecithin cholesterol acyltransferase,LCAT）基因3个编码区单核苷酸多态位点在中国人群中的分布频率，并初步探讨它们与脂代谢和冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary atherosclerotic heart disease,CHD）易感性的关系。方法：采用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性方法，分析209名正常人和203例CHD患者中608C／T、911T／C和1188C／T（参照序列：NM_000229）3个位点的多态性。结果：608C和608T等位基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡。CHD患者组608T频率显著低于正常人群（P＝0．034）。与无608T CHD患者相比，具有608T的CHD患者的血浆高密度脂蛋白胆固醇显著升高（P＝0．015）。911T／C和1188C/T在两组中均未检出。结论：LCAT基因608T等位基因与CHD患者较高的血浆高密度脂蛋白胆固醇水平相关联，可能与中国人CHD相关。911T／C和1188C／T在中国人群中非常罕见。     

PC12细胞氧糖剥夺/再灌注损伤中自噬与凋亡现象

目的观察氧糖剥夺/再灌注(OGD/OGD-R)诱导大鼠嗜铬细胞瘤细胞PC12细胞自噬和凋亡的发生及进展。方法PC12细胞经氧糖剥夺及再灌注处理建立OGD/OGD-R模型,在处理不同时间点,应用流式细胞仪检测OGD组及OGD-R组细胞活性和凋亡率;Western blot法检测自噬相关蛋白LC3、Beclin 1表达;免疫荧光法观察自噬小体;分别使用自噬上下游抑制剂(3-甲基腺嘌呤、E64 d+pepstatin A)进行调控,观察自噬的波动。结果随着氧糖剥夺时间的延长,OGD组细胞形态损伤逐步加重,凋亡率显著增高,呈时间依赖性;OGD-R组早期细胞活性略有恢复,随着再灌注时程的延长,细胞凋亡率逐渐增高。自噬相关蛋白LC3Ⅱ在OGD短暂处理后其表达即有上升,3 h左右达到峰值,6～8 h恢复到基础水平;Beclin 1蛋白呈先上升后平稳下降趋势。OGD 3 h时间点诱导自噬合并3-甲基腺嘌呤处理后自噬体减少明显;而E64 d+pepstatin A可导致LC3Ⅱ的积聚。OGD-R阶段LC3Ⅱ进一步升高至再灌注12 h后开始下降,Beclin 1蛋白表达呈升高趋势并持续至再灌注24 h。结论 OGD/OGD-R均能激活PC12细胞自噬与凋亡,可为探索自噬与凋亡间潜在的串流奠定基础。     

小自噬的研究进展

自噬(autophagy)是继坏死和凋亡后发现的第3种细胞死亡形式,与疾病的发生息息相关,是目前细胞领域研究的热点之一。自噬是指细胞在自噬相关基因(autophagy-related gene,Atg)的调控下利用溶酶体/液泡降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程,在进化过程中有高度的保守性。本文就目前小自噬(microautophagy)的研究近况作一综述。     

线粒体及其自噬在精子发生过程中的作用研究

精子活力是衡量精液质量和男性生育能力的一个重要临床指标。精子运动所需能量来自线粒体呼吸链的氧化磷酸化,线粒体形态、数目、酶活性、DNA完整性及活性氧（ROS）产生等的改变都影响精子生理功能。线粒体自噬是一种选择性的细胞自噬途径,作为一种清除损伤的线粒体和过量产生的ROS的防御机制,确保细胞内线粒体功能稳定,促进应激环境中细胞的存活。因此,推测精子细胞可能通过线粒体自噬这一特异性的选择途径清除异常线粒体以保护精子细胞生存并维持精子活力,自噬参与了精子的发生过程。     

三种方法建立神经元与星形胶质细胞共培养模型的对比研究

目的：比较神经元和星形胶质细胞共培养的3种不同方法,旨在获得高纯度的神经元。方法：采用新生大鼠作为神经元和星形胶质细胞体外培养的细胞来源,用混合培养、Banker共培养方法和插入式培养皿的方法建立神经元和星形胶质细胞共培养模型。结果：混合培养的神经元和星形胶质细胞同时生长在一个盖玻片上,不易控制胶质细胞的生长速度,神经元纯度不高;Banker共培养方法和插入式培养皿的方法均可获得高纯度的神经元,但 Banker 程序复杂;插入式培养皿的方法简化了 Banker 共培养程序。结论：利用插入式培养皿建立神经元和星形胶质细胞共培养体系,是一种值得推广的可用于体外细胞共培养相关研究工作的有效方法。［中国当代儿科杂志,2010,12(12)：984-987］