细胞色素c氧化酶亚基IV表达载体的构建及其在NB4细胞中的过表达

目的 构建细胞色素c氧化酶亚基IV(COXIV)的表达栽体并在NB4细胞进行过表达.方法 RT- PCR扩增COXIV编码序列并克隆到pcDNA6/His A质粒中,对重组质粒进行酶切鉴定和测序;将鉴定正确的pcDNA6- COXIV表达载体转染到NB4细胞中,Western blot鉴定COXIV蛋白在NB4细胞中的过表达.结果 所构建的pcDNA6-COXIV表达载体转染NB4细胞后,COXIV蛋白表达水平显著高于对照细胞.结论 COXIV表达载体构建成功,可介导COXIV蛋白在NB4细胞中的过表达,为进一步研究其功能奠定了基础.     

登革病毒4型E蛋白的表达与多克隆抗体的制备

 目的 在原核细胞中表达登革病毒4型E蛋白及E蛋白III区,分别以两种蛋白免疫家兔,获得可检测登革病毒的多克隆抗体。方法 将登革病毒4型E蛋白与E蛋白III区编码序列克隆到pET-32a（+）质粒中,分别构建两种蛋白的表达载体,以IPTG诱导其在Rosetta细胞中的大量表达,并进行SDS-PAGE检测。分别以两种蛋白免疫家兔,制备出针对E蛋白与E蛋白III区的多克隆抗体,并对其进行Western blot鉴定。结果 登革病毒4型E蛋白与E蛋白III区在Rosetta细胞中以包涵体的形式大量表达;利用所制备的多克隆抗体对登革病毒进行检测,出现了预期的条带。结论 本研究制备获得的多克隆抗体可用于登革病毒的检测,为登革病毒相关研究奠定了基础。     

乙型脑炎疫苗株SA14-14-2包膜蛋白279位氨基酸回复突变对其毒力的影响

目的:探索乙型脑炎病毒(JEV)疫苗株SA14-14-2包膜蛋白279位氨基酸(E279)MK回复突变(M279K)对其毒力的影响。方法:用重叠延伸PCR技术和基因克隆技术构建含有SA14-14-2包膜蛋白M279K突变的全长cDNA质粒pACNR-JEV(M279K),并以其为模板体外转录RNA,将RNA电转染导入BHK21细胞得到恢复病毒rJEV(M279K),并比较恢复病毒和疫苗病毒在蚀斑大小以及对小鼠神经毒力等方面的差别。结果:酶切及测序表明质粒模板成功构建,除人为引入的突变外(碱基1813处T→A),无任何碱基突变,并发现rJEV(M279K)形成比疫苗株更小的蚀斑,但毒力与疫苗株无显著差异。结论:E279回复突变影响乙脑疫苗SA14-14-2病毒蚀斑大小,但并未明显增强疫苗株对小鼠的神经毒力。     

亚硒酸钠诱导NB4细胞中细胞色素c氧化酶亚基IV的下调机制

目的 探讨亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡的过程中,细胞色素c氧化酶亚基IV(COX IV)表达的变化情况及其机制和意义.方法 用20μmol/L亚硒酸钠作用NB4细胞不同时间,Western blot和RT-PCR分别检测COX IV蛋白和mRNA表达的变化.活性氧清除剂预处理细胞后Western blot检测COX IV蛋白表达的变化以及caspase-3的激活.caspase-3抑制剂预处理细胞后Western blot检测COX IV蛋白表达的变化.瞬时转染干扰NB4细胞中COX IV表达后,流式细胞术检测细胞凋亡.结果 亚硒酸钠诱导NB4细胞COX IV蛋白表达显著下调,但mRNA表达水平无变化.活性氧清除剂能完全逆转亚硒酸钠引起的COX IV表达下调与caspase-3激活.caspase-3抑制剂能部分逆转亚硒酸钠引起的COX IV表达下调.干扰COX IV表达后,亚硒酸钠诱导的细胞凋亡显著增加.结论 在亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡过程中,COX IV在蛋白水平显著下调.活性氧介导COX IV下调与caspase-3激活,caspase-3在一定程度上参与COX IV表达下调,抑制COX IV能显著提高NB4细胞对亚硒酸钠诱导凋亡的敏感性.     

乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2感染性克隆的构建、鉴定及稳定性分析

目的 构建稳定的乙型脑炎病毒(JEV)疫苗SA14-14-2感染性克隆.方法 用基因重组技术把SA14-14-2全长 cDNA克隆到质粒pACNR中,并以其为模板转录RNA,将RNA电转导入BHK21细胞包装病毒,用蚀斑实验和间接免疫荧光法检测病毒,对病毒进行传代实验及序列分析,并比较恢复病毒和疫苗株在蚀斑大小、神经毒力等方面的差别.结果 酶切及测序表明质粒模板成功构建,用免疫荧光技术检测到恢复病毒蛋白表达,恢复病毒感染BHK21后可致细胞病变效应(CPE),传代实验表明病毒可以稳定感染BHK21细胞,测序表明:除人为引入的突变外(碱基473 A→C)无任何碱基突变,并发现恢复病毒在蚀斑形成、小鼠的神经毒力等特性方面同疫苗株相同.结论 成功构建了稳定的JEV感染性克隆,建立了用于JEV研究的反向遗传学方法,为研究JEV的致病机理、疫苗的减毒机制以及嵌合病毒疫苗的研发奠定基础.     

登革病毒1型E蛋白的原核细胞表达及多克隆抗体的制备

目的构建登革病毒1型（DENV-1）E蛋白的原核细胞表达载体并进行原核细胞表达,并制备其多克隆抗体。方法利用聚合酶链反应（PCR）扩增DENV-1E蛋白序列,经酶切后将其插入原核细胞表达载体pET-32a（＋）,构建重组质粒pET-32-D1-E。重组质粒转化E.Coli Rosetta（DE3）感受态细胞,目的蛋白经异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,纯化后采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）初步分析蛋白表达情况,并用纯化后的表达蛋白免疫家兔,制备该蛋白的多克隆抗血清,用间接酶联免疫吸附测定（ELISA）检测抗体的效价,Western blot检测抗体的特异性。结果成功构建了pET-32-D1-E原核细胞表达重组质粒,DENV-1E蛋白获得高效表达;纯化后的重组蛋白免疫家兔获得的特异性抗血清效价为1∶25 600,Western blot证实其特异性良好。结论成功构建了DENV-1E蛋白的原核细胞表达载体,并制备了可用于DENV快速检测的高效多克隆抗体。     

生物制品中逆转录酶活性检查假阳性结果的原因分析及对策

目的对造成生物制品中逆转录酶活性检查假阳性结果的原因进行分析和讨论,并探讨相应的对策。方法查阅生物制品中逆转录酶活性检查方法的相关文献,并结合实际工作中的检定结果进行分析总结。结果多种因素可造成逆转录酶活性检查结果的假阳性,可针对这些原因采取相应的策略。结论逆转录酶活性检查方法的进一步完善,对于生物制品的质量控制具有十分重要的意义。