Smad3沉默对IGFBPrP1诱导肝星状细胞分泌细胞外基质作用的影响

目的 明确胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(insulin-like growth factor binding protein related protein1,IGFBPrP1)是否通过Smad3信号通路影响肝星状细胞分泌细胞外基质.方法 (1)化学合成2对针对Smad3基因的siRNAs(siRNA1,siRNA2),转染肝星状细胞株(HSC-T6).采用实时定量PCR和Western blot法筛选抑制效率较高的siRNA用于干扰实验;(2)将肝星状细胞株(HSC-T6)分为4组:阴性对照组、siRNA-Smad3转染组、siRNA-Smad3+IGFBPrP1组和IGFBPrP1组.将筛选的抑制效率较高的siRNA转染HSC-T6细胞株,田Western b1ot检测各组Smad3、纤维连接蛋白及Ⅰ型胶原的表达.结果 (1)siRNA2-Smad3对Smad3的抑制效率较高;(2)与阴性对照组相比,siRNA-Smad3转染组Smad3蛋白的表达显著下降(P＜0.01).与IGFBPrP1组相比,siRNA-Smad3+IGFBPrP1组纤维连接蛋白和Ⅰ型胶原蛋白的表达均显著降低(P＜0.01).结论 IGFBPrP1影响肝星状细胞分泌细胞外基质的机制之一是通过Smad3信号通路来实现的.

Abstract：

Objective To identify the effect of IGFBPrP1 on the secretion of extracellular matrix in hepatic stellate cells through the Smad3 signaling pathway. Methods (1)Two pairs of chemically synthesized siRNAs (siRNA1, siRNA2) targeting Smad3 were transfected into HSC-T6 cells,real-time PCR and Western blot were used to evaluate the silence efficiency, and the better siRNA was used. (2)HSC-T6 cells were divided into four groups: Negative control group, siRNA-Smad3 transfection group, siRNA-Smad3+IGFBPrP1 group and IGFBPrP1 group. The better siRNA was chosen to transfect into HSC-T6 cells. The protein expressions of Smad3, fibronectin and Collagen Ⅰ were evaluated by Western blot. Results (1)siRNA2-Smad3 inhibited Smad3 gene expression stronger than another siRNA. (2)After transfection of siRNA2-Smad3, the protein expression of Smad3 was significantly decreased compared to the negative control group(P＜0.01). The protein expression of fibronectin and Collagen Ⅰ in IGFBPrP1 stimulating HSCs treated with siRNA2-Smad3 were significantly decreased compared to that in IGFBPrP1 stimulating HSC without siRNA2-Smad3 (P ＜0. 01 ).Conclusion IGFBPrP1 induces the secretion of extracellular matrix in hepatic stellate cells through the Smad3 signaling pathway.     

胶囊渗透压泵控释rmIGFBPrPl对小鼠肝肾组织的影响及意义

目的胶囊渗透压泵植入野生型小鼠皮下并持续恒量释放重组鼠胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1（rmIGFBPrP1）,观察小鼠肝肾纤维化相关指标的表达,探讨rmIGFBPrPl对小鼠肝肾组织的影响及其可能的意义。方法将清洁级雄性C57BL／6野生型小鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型组。采用胶囊渗透泵控释rmIGFBPrP1制备肝纤维化模型。HE染色、天狼猩红染色观察各组小鼠肝肾病理改变及胶原纤维沉积状况。免疫组织化学染色检测肝肾组织中IGFBPrP1、Smad3、P—Smad2／3、Ⅲ型胶原（Collagen Ⅲ）的表达和分布。原位缺口末端标记技术（TUNEL）检测肝细胞凋亡。结果与对照组和假手术组相比,模型组肝组织中胶原纤维含量增多,IGFBPrP1、Smad3、P—Smad2／3、Collagen Ⅲ表达增强（P〈0．01）。模型组肾组织中仅IGFBPrP1表达较对照组和假手术组有所增加,胶原纤维和其他指标表达未见差异（P〉0．05）。TUNEL结果显示模型组肝细胞凋亡率增高,与正常组和假手术组相比,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论外源性IGFBPrP1可促进小鼠肝细胞凋亡和肝纤维化的形成,而对小鼠肾组织影响甚微。IGFBPrP1致小鼠脏器组织纤维化可能具有选择性。     

小鼠肝组织中胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1在肝纤维化发生及发展中的作用

Objective To investigate the effect of insulin-like growth factor binding protein-related protein 1 ( IGFBPrP1 ) in the formation and development of hepatic fibrosis. Methods Hepatic fibrosis model of mice was made by intraperitoneal injecting with thioacetamide, then the mice were sacrificed four, five and six weeks later (10 mice were sacrificed at each time point, model groups). Mice in the control groups were treated by normal saline (6 mice were sacrificed at each time point). Collagen accumulation in liver tissues was detected by Masson stain. Distribution and dynamic expressions of IGFBPrP1, alpha-smooth muscle actin ( α-SMA ),Collagen Ⅰ , fibronectin ( FN), TGF-β1 and Smad3 in different groups were detected by immunohistochemistry.The expressions of IGFBPrP1, α-SMA and Smad3 were detected by Western blot. All data were analyzed using the analysis of variance (ANOVA), Pearson rank correlation coefficient. Results The expressions of IGFBPrP1 in the liver tissues were increased from 0.21 ±0.03 to 5.03 ±0.09, α-SMA from 0. 11 ±0.04 to 10.09 ±0. 18,Collagen Ⅰ from 0.22 ±0.01 to 11.01 ±0. 16, FN from 0.31 ±0.09 to 19.81 ±1.62, TGF-β1 from 0.49 ±0.02 to 5.97 ± 0. 19, and Smad3 from 0.22 ± 0.03 to 2.03 ± 0.07. Compared with the control groups, the expressions of IGFBPrP1, α-SMA, Collagen Ⅰ , FN, TGF-β1 and Smad3 in the model groups were significantly increased as time passed by ( F = 783. 141,998. 200,886. 715,935. 242, 931. 241,697. 118, P < 0. 05 ). During the formation of hepatic fibrosis, the expression of IGFBPrP1 was positively correlated with the expressions of α-SMA,Collagen Ⅰ , FN, TGF-β1 and Smad3 ( r = 0. 906, 0. 927, 0. 988, 0. 947, 0. 977, P < 0.05 ). The results of Western blot showed that the protein expression of IGFBPrP1 was increased from 0. 23 ± 0.01 to 0.92 ± 0.07,α-SMA from 0.36 ± 0. 02 to 1.39 ± 0.03, FN from 0.03 ± 0.00 to 0.12 ± 0.02, and Smad3 from 0.09 ± 0. 01 to 0.56 ±0.04. The protein expressions of IGFBPrP1, α-SMA, FN and Smad3 were significantly increased in the model groups when compared with the control groups (F =57. 316, 201. 214, 103. 871, 72. 966, P <0.05).During the formation of hepatic fibrosis. IGFBPrP1 was positively correlated with the expressions of α-SMA, FN and Smad3 (r = 0. 982, 0. 924, 0. 965, P < 0.05 ). Conclusions The expression of IGFBPrP1 increases as the aggravation of the fibrosis. IGFBPrP1 promotes the formation and development of hepatic fibrosis by activating hepatic stellate cells, accelerating the synthesis and secretion of Collagen Ⅰ and FN which are the principal components of extracellular matrix, and affecting the TGF-β1/Smad3 pathway.     

小鼠肝组织中胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1在肝纤维化发生及发展中的作用

目的 探讨小鼠肝组织中胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(IGFBPrP1)在肝纤维化发生及发展过程中的作用.方法 采用腹腔注射硫代乙酰胺制备小鼠肝纤维化模型,按时间将小鼠分为模型4、5、6周组(各10只),并分别设立正常对照组(各6只),采用Masson染色检测肝组织胶原沉积,免疫组织化学检测肝组织中IGFBPrP1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ)、纤维连接蛋白(FN)、TGF-β1和Smad3蛋白表达和分布,同时以Western blot检测IGFBPrP1、α-SMA和Smad3蛋白表达.采用单因素方差分析、Pearson等级相关检验进行分析,以P<0.05为差异有统计学意义.结果 免疫组织化学检测结果发现,模型组小鼠肝组织中IGFBPrP1由0.21±0.03上升到5.03±0.09,α-SMA由0.11±0.04上升到10.09±0.18,Collagen Ⅰ由0.22±0.01上升到11.01±±0.16,FN由0.31±0.09上升到19.81±1.62,TGF-β1由0.49±0.02上升到5.97±0.19,Smad3由0.22±0.03上升到2.03±0.07,这些检测因子在模型组的表达与正常对照组比较,随时间的增加而明显增强(F=783.141,998.200,886.715,935.242,931.241,697.118,P<0.05).在肝纤维化形成过程中,IGFBPrP1的表达与α-SMA、Collagen Ⅰ、FN、TGF-β1和Smad3的表达均呈正相关(r=0.906,0.927,0.988,0.947,0.977,P<0.05).Western blot检测结果发现,模型组小鼠肝组织的IGFBPrP1蛋白表达量由0.23±0.01上升到0.92±0.07,α-SMA蛋白表达量由0.36±0.02上升到1.39±0.03,FN蛋白表达量由0.03±0.00上升到0.12±0.02,Smad3蛋白表达量由0.09±0.01上升到0.56±0.04,模型组小鼠的蛋白表达量均较正常对照组明显升高(F=57.316,201.214,103.871,72.966,P<0.05).在肝纤维化形成过程中,IGFBPrP1的表达与α-SMA、FN和Smad3的表达均呈正相关(r=0.982,0.924,0.965,P<0.05).结论 IGFBPrP1随着肝纤维化程度的加重,其表达水平逐渐上调,IGFBPrP1的促肝纤维化作用可能与促进肝星状细胞激活、使细胞外基质的重要组成成分Collagen Ⅰ和FN的合成与分泌增加及影响TGF-β1/Smad3信号通路有关.     

丹参酮ⅡA对损伤肝细胞的保护作用及活化肝星状细胞的抑制作用

目的探索丹参酮ⅡA对体外培养肝细胞株HL-7702的安全使用剂量并观察丹参酮ⅡA对肿瘤坏死因子α(TNF-α)和过氧化氢(H2O2)所致体外培养肝细胞损伤的保护作用;同时探讨丹参酮ⅡA对活化肝星状细胞增殖的抑制作用。方法体外培养人肝细胞株HL-7702,加入不同浓度的丹参酮ⅡA,通过MTT比色法检测肝细胞存活率并检测培养上清液中丙氨酸转氨酶(ALT)和乳酸脱氢酶(LDH)含量的变化。建立TNF-α和H2O2所致肝细胞损伤模型,测定培养上清液中的ALT和LDH含量,同时用MTT比色法检测肝细胞存活率。体外培养大鼠肝星状细胞株HSC-T6,加入不同浓度的丹参酮ⅡA,通过MTT比色法检测肝星状细胞存活率。结果①丹参酮ⅡA在一定的剂量范围内对肝细胞无细胞毒性,超过该剂量时,其细胞毒性表现为细胞存活率下降和肝细胞合成分泌的ALT、LDH水平增高。②丹参酮ⅡA可改善TNF-α所致肝细胞存活率下降及ALT、LDH水平的增高。③丹参酮ⅡA可改善H2O2所致肝细胞存活率的下降。④丹参酮ⅡA可抑制活化肝星状细胞的增殖。结论①丹参酮ⅡA对于体外培养肝细胞株(HL-7702)的安全剂量范围为1～2μg/ml。②丹参酮ⅡA在安全剂量范围内能改善TNF-α和H2O2所致体外培养人肝细胞株的损伤。③丹参酮ⅡA在25～100μg/ml的剂量范围内可以有效抑制活化肝星状细胞的增殖。     

胰岛素样生长因子结合蛋白7在活化肝星状细胞促肝纤维化中的作用

目的 探讨胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)对肝星状细胞-T6合成分泌纤维连接蛋白的调节作用及抗IGFBP7抗体诱导肝星状细胞-T6凋亡的作用.方法 体外培养活化的肝星状细胞-T6分为5组:(1)空白对照组;(2)IGFBP7 20μg/L组;(3)抗IGFBF7抗体0.25 mg/L组;(4)抗IGFBP7抗体0.50 mg/L组;(5)抗IGFBP7抗体1.00 mg/L组.采用Western blot及ELISA法检测肝星状细胞-T6经IGFBP7作用24 h后纤维连接蛋白的表达及合成分泌量的变化;MTT比色法检测抗IGFBP7抗体对肝星状细胞-T6作用14 h后增殖抑制的影响,同时用流式细胞仪测定抗IGFBP7抗体对肝星状细胞-T6凋亡发生率的影响.采用单因素方差分析,两样本均数比较采用t检验,多重比较采用SNK-q检验.结果 肝星状细胞-T6经IGFBP7作用后纤维连接蛋白的表达及合成分泌量较空白对照组显著增加(t=22.06,7.43,P<0.05).抗IGFBP7抗体对肝星状细胞-T6的增殖具有明显抑制作用(F=14.70,P<0.05).抗IGFBP7抗体能够上调肝星状细胞-T6的凋亡率(F=63.79,P<0.05).结论 IGFBP7能够使细胞外基质的重要组成成分纤维连接蛋白的合成与分泌增加,抗IGFBP7抗体可以抑制肝星状细胞-T6的增殖并诱导其发生凋亡.     

siRNA抑制IGFBPrP1表达对肝星状细胞株分泌细胞外基质的影响

目的利用化学合成的siRNA抑制肝星状细胞（HSC）中胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1（IGFBPrP1）基因的表达,观察其对HSC产生细胞外基质（ECM）的影响,以明确IGFBPrP1在肝纤维化中的作用地位。方法 （1）化学合成2对针对IGFBPrP1基因的siRNAs,转染肝星状细胞株HSC-T6,筛选抑制率较高的siRNA用于干扰实验;（2）将HSC-T6分为3组：正常对照组、阴性对照组和IGFBPrP1 siRNA干扰组。将筛选的抑制效率较高的siRNA转染HSC-T6,Western Blot检测其IGFBPrP1、Ⅰ型胶原（ColⅠ）和纤维连接蛋白（FN）的表达。采用单因素方差分析,多重比较采用SNK-q检验。结果 （1）将2对IGFBPrP1 siRNA转染HSC,筛选出能高效抑制IGFBPrP1表达的siRNA;（2）与正常对照组和阴性对照组相比,IGFBPrP1 siRNA干扰组能明显抑制IGFBPrP1、ColⅠ和FN的表达（F=48.018、81.246、43.850,P〈0.01）。结论 IGFBPrP1 siRNA能特异性抑制HSC中IGFBPrP1的表达,进而使HSC中ECM的重要成分ColⅠ和FN合成和分泌减少,故IGFBPrP1可在肝纤维化中起有重要作用。     

IGFBPrP1 siRNA诱导的大鼠肝星状细胞凋亡及其机制

目的研究IGFBPrP1 siRNA对大鼠肝星状细胞凋亡的影响,并探讨其可能的机制。方法体外培养大鼠肝星状细胞株（HSC-T6）,分别设立：正常对照组,阴性对照组,IGFBPrP1 siRNA转染组。IGFBPrP1 siRNA转染大鼠肝星状细胞,转染不同时间后,用CCK-8试剂盒检测肝星状细胞增殖的变化,AnnexinV/PI双标法流式细胞术检测肝星状细胞凋亡的变化,免疫细胞化学染色法检测P53及Bcl-2蛋白表达的变化。结果 （1）IGFBPrP1 siRNA转染大鼠肝星状细胞不同时间（24、48、72 h）后,转染组细胞增殖受到抑制且凋亡率明显增高,与正常对照组及阴性对照组相比,差异均有统计学意义（P〈0.01）;（2）IGFBPrP1 siRNA转染大鼠肝星状细胞48 h后,与正常对照组及阴性对照组相比,转染组P53蛋白的表达量显著增高（P〈0.01）;Bcl-2蛋白的表达明显降低（P〈0.01）。结论 IGFBPrP1 siRNA能显著抑制大鼠肝星状细胞增殖且能促进其凋亡;上调P53的表达,下调Bcl-2的表达可能是IGFBPrP1 siRNA诱导大鼠肝星状细胞凋亡的途径之一;推测抑制IGFBPrP1的表达有可能成为治疗肝纤维化的新靶点。     

胰岛素样生长因子结合蛋白2、4在实验性肝细胞损伤中的表达及意义

目的：通过观察肿瘤坏死因子α (TNF -α)和转化生长因子β1（TGF-β1）两种细胞因子所致体外培养的肝细胞损伤时胰岛素样生长因子结合蛋白2、4(IGFBP2、IGFBP4)的表达变化,探讨IGFBP2和IGFBP4在肝损伤中的作用机制。方法：对人肝细胞株HL-7702分别给予不同浓度的TNF-α、TGF-β1两种处理因素作用24 h,采用免疫细胞化学染色法观察其IGFBP2和IGFBP4的表达变化,再在相同处理培养条件下用MTT比色法检测两种细胞因子对肝细胞抑制率的影响。根据MTT及预实验结果选择TNF-α 20 μg/L作用于人肝细胞株48h,采用Annexin-Ⅴ/PI双染色流式细胞分析法和TUNEL法检测肝细胞凋亡发生率。结果：与对照组相比,各处理组IGFBP2、IGFBP4的表达均显著增加(P<0.05),其中在TNF-α 20 μg/L组和TGF-β1 4 μg/L组表达最强,且与肝细胞抑制率呈正相关关系(P<0.05 or P<0.01)。TNF-α 20 μg/L处理48 h后肝细胞凋亡率明显增加(P<0.01)。结论：IGFBP2、IGFBP4参与了肝细胞的损伤过程,在TNF-α、TGF-β1介导的肝细胞损伤中具有重要作用。     

丹参酮ⅡA对小鼠肝纤维化的干预作用

目的 通过观察胰岛素样生长因子结合蛋白7（IGFBP7）、转化生长因子-β1 (TGF- β1）/Smad3信号通路在丹参酮ⅡA作用的肝纤维化小鼠肝组织中的作用，探讨丹参酮ⅡA护肝作用的新机制。 方法 腹腔注射硫代乙酰胺（TAA）制备肝纤维化模型。将36只雄性昆明小鼠随机分为5组：正常对照组、4周模型组、4周预防组、6周模型组、3周治疗组。检测血清丙氨酸氨基转氨酶（ALT）和乳酸脱氢酶（LDH）活力，进行HE和Masson染色观察肝组织形态学变化，免疫组织化学染色检测α-平滑肌肌动蛋白(α--SMA)、Ⅰ型胶原(collagenⅠ)、纤维粘连蛋白(FN)、TGF-β1、Smad3和IGFBP7的表达；用TUNEL方法检测肝细胞凋亡；Western blot 检测肝组织FN、Smad3和 IGFBP7的含量。 结果 分别与4周和6周模型组比较，4周预防组和3周治疗组血清ALT、LDH含量明显降低，肝组织损伤显著改善，肝细胞凋亡指数降低；肝组织α-SMA、collagenⅠ、FN、TGF-β1、Smad3和IGFBP7的表达亦明显减少；肝组织FN、IGFBP7和Smad3含量减少，各组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。 结论 丹参酮ⅡA具有改善肝功能、抑制肝星状细胞活化、减少细胞外基质(ECM)生成、保护肝细胞的作用，其机制可能与阻止TGF-β1/Smad3信号通路，降低肝组织IGFBP7的表达有关。