TGF-β1调控肺泡上皮细胞PI3K亚基构成变化的研究

目的探讨肺泡上皮细胞（AECs）中PI3K亚基的表达情况和TGF-茁1是否可以调控PI3K亚基的构成变化。方法采用实时定量PCR法检测AECs中PI3K亚基mRNA的表达情况,予5ng/mlTGF-茁1刺激A549细胞0、3、6、12、24和48h不同时间点,实时定量PCR法检测PI3K亚基mRNA的表达变化,Westernblot法检测PIK3CD蛋白表达水平。结果AECs中Ⅰ型PI3K催化亚基以表达PIK3CA、PIK3CB和PIK3CD为主,Ⅰ型PI3K调节亚基以表达PIK3R1、PIK3R2和PIK3R3为主,Ⅱ型PI3K亚基和Ⅲ型PI3K亚基以表达PIK3R4、PIK3C3、PIK3C2A和PIK3C2B为主。TGF-茁1刺激可以调控Ⅰ型PI3K催化亚基中的PIK3CDmRNA和蛋白的表达呈时间依赖性升高。结论AECs中Ⅰ型PI3K亚基、Ⅱ型PI3K亚基和Ⅲ型PI3K亚基均有不同程度表达,TGF-茁1经调控PIK3CD的表达导致Ⅰ型PI3K催化亚基的构成变化。     

基质蛋白CCN1与肺部疾病的研究进展

正富半胱氨酸蛋白61(cysteine-rich angiogenic inducer 61,Cyr61/CCN1)是即刻早期基因(early growth response gene,Egr)编码的富含半胱氨酸的分泌型基质蛋白,属于CCN家族成员之一。CCN家族包括CCN1、结缔组织生长因子、肾母细胞瘤过度表达基因、Wnt诱导分泌蛋白(Wnt-induced secreted protein,     

CCN1在脂多糖诱导急性肺损伤中的表达调控和在炎症反应中的作用

目的:体内观察富半胱氨酸蛋白61(CYR61/CCN1)在正常肺组织中的表达定位和在脂多糖(LPS)诱导小鼠急性肺损伤中的表达变化,体外研究LPS调控CCN1表达的分子机制和CCN1在LPS诱导炎症介质表达中的作用。方法:分别通过免疫组化(IHC)染色及免疫荧光法观察CCN1在小鼠肺组织和气道上皮细胞16HBE中的表达定位;气道滴注LPS建立小鼠急性肺损伤模型,IHC观察CCN1在肺组织中的表达变化;体外研究中,分别予气道上皮16HBE细胞以ERK1/2、JNK、P38和PI3K信号通路特异性抑制剂预处理2 h后加入LPS刺激,通过RT-qPCR和Western blot检测CCN1的mRNA和蛋白表达变化;分别通过CCN1-siRNA和重组CCN1蛋白刺激16HBE细胞,qPCR检测炎症介质白细胞介素6(IL-6)、IL-8、转化生长因子β(TGF-β)和血管内皮生长因子(VEGF)的mRNA水平。结果:CCN1在正常肺组织中以气道上皮表达为主,在LPS诱导的急性肺损伤小鼠气道上皮细胞中CCN1表达升高;LPS可刺激16HBE细胞中CCN1的表达水平升高,其中ERK1/2、JNK、P38和PI3K信号通路特异性抑制剂可以不同程度逆转LPS诱导的CCN1表达升高。重组CCN1蛋白可以诱导16HBE细胞中IL-6、IL-8、TGF-β和VEGF的mRNA合成,干扰CCN1可以部分逆转LPS刺激后IL-6、IL-8、TGF-β和VEGF的mRNA合成。结论:气道上皮来源的CCN1在急性肺损伤中表达升高,其表达调控涉及ERK1/2、JNK、P38和PI3K信号通路;CCN1在介导LPS诱导的炎症介质表达过程中发挥了重要作用。本研究为未来急性肺损伤诊治的潜在靶点提供了一定的理论基础。     

GPC3-WNT-JNK通路介导脂多糖诱导肺局部细胞炎症

目的：探讨GPC3在脂多糖（LPS）诱导的气道上皮细胞局部炎症微环境中的重要作用,并以GPC3-WNT通路介导的调控机制为核心进一步研究LPS诱导的肺局部炎症分子机制。方法：LPS经气道滴入小鼠后模拟肺损伤模型,检测肺泡灌洗液及肺组织中GPC3表达情况以及其表达位置。培养人肺16HBE细胞,LPS刺激16HBE细胞建立急性炎症细胞,予以RT-PCR检测其细胞中GPC3、TNF-α和TGF-β的mRNA表达情况,予以Western Blot检测GPC3、TGF-β和TNF-α蛋白表达情况。加入外源性GPC3刺激16HBE细胞,建立GPC3高表达细胞模型,检测炎症因子TNF-α和TGF-β mRNA的表达情况。不同浓度GPC3-WNT通路抑制剂处理细胞,观察上述指标变化。结果：LPS诱导ALI小鼠模型显示GPC3表达水平显著提高。此外,LPS在体外也产生了GPC3表达升高的现象。同时,外源性GPC3蛋白刺激支气管上皮细胞产生多种炎症因子,可能提示GPC3具有促炎作用。此外,GPC3诱导支气管上皮细胞系炎性细胞因子的产生被WNT-JNK通路的抑制剂阻断,提示ALI/ARDS过程中GPC3参与肺局部的潜在信号通路。结论：LPS刺激支气管上皮细胞的过程中存在一条线性信号通路即GPC3-WNT-JNK。这一发现可能为ALI/ARDS的治疗和生物标志物的开发提供一个新的分子靶点和分子机制。     

FGF10干预PM诱导支气管上皮细胞COX2/PGE2表达的分子机制

目的探讨成纤维生长因子10（FGF10）对细颗粒物（PM）诱导支气管上皮细胞表达环氧合酶2/前列腺素E2（COX2/PGE2）的作用及其分子机制。方法雄性C57BL/6小鼠给予0.5mg/kgFGF10腹腔注射和4.0mg/kgPM气道滴注,构建动物模型,设置空白组、FGF10组、PM组和PM+FGF10组。获取各组肺组织并进行病理分级评分,采用Westernblot法检测各组肺组织中COX2的相对表达量,采用免疫荧光法检测支气管上皮中COX2的相对表达量,采用ELISA法检测肺泡灌洗液中PGE2的分泌水平。先给予5mmol/LERK1/2抑制剂（U0126）/PI3K抑制剂（LY294002）干预,然后10μg/LFGF10干预,最后200mg/LPM刺激支气管上皮细胞BEAS-2B,构建细胞模型,设置空白组、PM组、PM+FGF10组、PM+FGF10+LY294002组和PM+FGF10+U0126组。采用ELISA法检测各组细胞PGE2分泌水平,采用Westernblot法检测各组细胞COX2的表达水平。同时进行细胞计数、线粒体功能和乳酸脱氢酶分泌分析等细胞功能检测。结果动物模型中,气道滴注PM诱导C57BL/6小鼠支气管病理形态学的改变,伴随肺泡灌洗液中PGE2分泌增多（P＜0.05）,肺组织COX2表达升高（P＜0.05）,支气管上皮COX2荧光强度升高（P＞0.05）。FGF10干预下,PM诱导支气管炎症和COX2/PGE2表达被逆转（P＜0.05）。细胞模型中,PM诱导支气管上皮细胞COX2/PGE2表达水平升高（P＜0.05）,FGF10干预下,COX2/PGE2的表达均降低（P＜0.05）,BEAS-2B细胞计数、线粒体功能和乳酸脱氢酶分泌等细胞功能改变（P＜0.05）。就分子机制而言,LY294002和U0126逆转了FGF10对PM诱导COX2/PGE2表达的调控作用（P＜0.05）。结论FGF10可以调控PM对支气管上皮细胞COX2/PGE2的诱导表达,其分子机制涉及MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路。