微课和雨课堂在分子医学技术中的实践研究

以高校医学专业分子医学实验技术教学为例,从教学理念树立、教学方法运用、教学环节衔接三个方面对“微课+雨课堂”混合式教学模式进行了全面、系统的应用设计。通过“微课+雨课堂”混合式教学模式在分子医学实验技术教学中的实践运用,学生的学习质量得到提高、教师的教学能力得到拓展、教学相长的氛围得到加强。     

下调蛋白激酶Wee1B表达对小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂的促进作用

目的:利用特异性发夹结构Wee1BshRNA,探讨蛋白激酶Wee1B对小鼠受精卵早期发育的影响。方法:超排卵方法获得小鼠1-细胞期受精卵并显微注射质粒,实验分为未注射组、TE缓冲液注射组、Control shRNA注射组和Wee1BshRNA注射组,收集各组卵细胞后用RT-PCR和Western blotting方法检测Wee1B shRNA的干涉效能;荧光显微镜观察受精卵的形态变化、计数卵裂率;放射自显影测定Wee1B活性。结果:与TE缓冲液和Control shRNA注射组比较,Wee1BshRNA注射组小鼠1-细胞期受精卵Wee1BmRNA水平和蛋白表达显著降低;与其他3组比较,Wee1BshRNA注射组Wee1B的激酶活性明显降低;未注射组、TE缓冲液注射组和Control shRNA注射组在hCG注射33h后1-细胞期受精卵的卵裂率分别为71.91%±1.74%、72.90%±2.25%和72.28%±2.06%,3组间比较差异无统计学意义(P>0.05);而Wee1BshRNA注射组的卵裂率提高18.00%,为90.00%±0.77%,与其他3组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:Wee1B表达沉默可提高小鼠1-细胞期受精卵的卵裂率,说明Wee1B负调控小鼠受精卵有丝分裂的进程。     

人卵巢cDNA文库中与蛋白激酶Wee1B相互作用的候选分子的筛选及其调控作用

目的：利用酵母双杂交系统筛选与蛋白激酶Wee1B相互作用的新候选分子,并用生物信息学方法分析其与Wee1B相互作用是否能调控小鼠受精卵早期发育。方法：以pcDNA3.1/V5 His TOPO Wee1B WT质粒为模板构建pGBKT7 Wee1B诱饵质粒;制备酵母感受态细胞,将诱饵质粒pGBKT7 Wee1B转化酵母感受态细胞后分别接种SD/Trp（SDO）、SD/Trp/X α Gal（SDO/X）和SD/Trp/X α Gal/AbA plates（SDO/X/A）培养板检测其对酵母的毒性和自身激活能力,利用Western blotting法检测pGBKT7 Wee1B在酵母中的表达情况;将含有pGBKT7 Wee1B的酵母感受态细胞与人卵巢cDNA文库相融合,利用酵母双杂交系统筛选出阳性克隆,提取阳性克隆的酵母质粒转化大肠杆菌后进行测序鉴定,最终再经酵母重新转化验证。在GenBank中对其进行BLAST分析,根据基因注释推断其在小鼠受精卵发育过程中可能发挥的作用。结果：双酶切鉴定和测序分析,pGBKT7 Wee1B诱饵质粒构建成功。将该质粒转入酵母感受态细胞后在SDO/X/A平皿上无克隆。将pGBKT7 Wee1B和pGBKT7空载体转入酵母感受态细胞中,菌液接种于SDO平皿,2个SDO平皿上克隆都均匀生长。从工作板SDO和阳性对照板上挑取阳性克隆扩大培养,裂解细胞提取蛋白,Western blotting法检测示pGBKT7 Wee1B对应位置出现条带。含诱饵质粒的酵母菌与人卵巢cDNA文库融合,PCR验证融合后的阳性克隆质粒有插入片段。将质粒测序并经BLAST分析筛选出9个与Wee1B蛋白激酶存在相互作用的蛋白,生物信息学分析可能与小鼠卵母细胞发育和受精卵发育密切相关的蛋白。结论：利用酵母双杂交系统从人卵巢cDNA文库中筛选出9个与Wee1B蛋白激酶相互作用的蛋白,这些筛选蛋白可能通过与Wee1B相互作用调控小鼠卵母细胞成熟和受精卵早期发育。     

应用酵母双杂交系统筛选与蛋白激酶Pkmyt1相互作用的候选分子

目的蛋白激酶Pkmyt1负调控小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂的进程,但具体调控机制还不清楚。因此,利用酵母双杂交系统从人卵巢c DNA文库中筛选与Pkmyt1相互作用的候选蛋白,为研究Pkmyt1调控小鼠受精卵早期发育提供新线索。方法以小鼠卵巢组织c DNA为模板,构建p GBKT7-Pkmyt1诱饵质粒,转化酵母感受态细胞后,分别接种于SD/-Trp(SDO)、SD/-Trp/X-α-Gal(SDO/X)和SD/-Trp/X-α-Gal/Ab A plates(SDO/X/A)培养板,检测其对酵母的毒性和自身激活能力,Western blotting法检测p GBKT7-Pkmyt1在酵母细胞中的表达。将人卵巢c DNA文库与含有p GBKT7-Pkmyt1的酵母感受态细胞融合,PCR筛选出阳性克隆,提取质粒,测序鉴定,再次检测其对酵母自激活能力,利用生物信息学分析筛选蛋白与胚胎发育的关系。结果酶切鉴定和Blast分析表明p GBKT7-Pkmyt1质粒构建成功。将该质粒转入Y2H golden中,在SDO板上克隆均匀生长,在SDO/X/A平皿上无克隆生长,Western blotting检测Pkmyt1在酵母细胞中有表达。PCR验证融合后的阳性克隆质粒有插入片段。通过初步筛选得到182种能够与Pkmyt1相互作用的蛋白质,经回复性实验进一步验证有46个与Pkmyt1之间存在相互作用的蛋白。结论通过筛选发现46个蛋白可能通过与Pkmyt1相互作用调控小鼠卵母细胞成熟和受精卵早期发育。     

蛋白激酶Pkmyt1对小鼠1-细胞期受精卵发育的抑制作用

目的: 通过在小鼠1-细胞期受精卵内过表达Pkmyt1-wild type(WT) (野生型) mRNAs,研究蛋白激酶Pkmyt1对小鼠受精卵早期发育的影响,为进一步阐明Pkmyt1对哺乳动物受精卵早期发育调控的机制奠定基础。方法: 构建pcDNA3.1/myc- Pkmyt1-WT质粒。超排卵方法获得小鼠1-细胞期受精卵,实验分为未注射组、TE缓冲液注射组和Pkmyt1-WT mRNAs注射组,收集各组卵细胞后采用Western blotting法检测Pkmyt1蛋白表达和Cdc2-pTyr15磷酸化状态;相差显微镜观察受精卵的形态变化并计数卵裂率。结果: pcDNA3.1/myc-Pkmyt1-WT质粒构建成功。与未注射组(0.414±0.016)和TE缓冲液注射组(0.441±0.013)比较,受精卵显微注射Pkmyt1-WT mRNAs 4 h后,Pkmyt1蛋白表达水平(1.112±0.025)增高(P<0.01)。与未注射组(60.81%±3.27%)和TE缓冲液注射组(61.79%±4.08%)比较,Pkmyt1-WT-mRNA注射组卵裂率(34.2%±3.25%)显著降低 (P<0.01)。Pkmyt1-WTmRNA注射组在注射hCG后29.0 h检测到微弱的磷酸化信号,29.5 h检测不到任何磷酸化信号。结论: Pkmyt1过表达后磷酸化Cdc2-pTyr15可抑制小鼠1-细胞期受精卵的卵裂率,提示Pkmyt1负调控小鼠受精卵有丝分裂的进程。     

WEE1B和CDC25B蛋白核浆转位调控小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂进程

摘要:目的　通过观察内外源性蛋白激酶WEE1B和蛋白磷酸酶CDC25B在小鼠1-细胞期受精卵中不同细胞时期的定位,为深入研究WEE1B和CDC25B的核浆转位机制奠定基础。方法　对小鼠超排卵获得各期受精卵后,免疫荧光观察各期受精卵内源性WEE1B和CDC25B蛋白定位;将pEGFP-CDC25B-WT和pDsRED2-N1-WEE1B-RFP融合质粒显微注入G1期受精卵中,观察各组小鼠1-细胞期受精卵中外源性WEE1B和CDC25B蛋白亚细胞定位。结果　在小鼠1-细胞期受精卵G2/M期转换过程中,WEE1B向细胞浆转位和CDC25B向细胞核转位。结论　WEE1B和CDC25B在小鼠受精卵G2/M转换过程中存在核浆转位的动态平衡,本研究对阐明WEE1B和CDC25B调控小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂过程和生殖机理具有十分重要意义。