应用搅拌式生物反应器大量扩增人胎盘间充质干细胞的实验研究

探讨应用搅拌式生物反应器培养技术体外扩增人胎盘间充质干细胞(hPDMCs)的方法.以 hPDMCs为种子细胞,利用微载体悬浮法在搅拌式生物反应器内进行体外培养,同时设置静态培养的培养瓶为对照组,观察细胞的扩增速率、细胞代谢(乳酸、葡萄糖、培养液的pH值)的变化,检测生物反应器培养前、后干细胞的表面标记物.hPDMCs 在搅拌式生物反应器内每代可以扩增 (10.55±1.62) 倍,明显高于对照组 (6.10±0.11) 倍的扩增值(P＜0.05),且细胞生长代谢指标优于对照组;流式细胞仪检测应用搅拌式生物反应器,培养后细胞表面标记物的表达率无明显改变(P>0.05). 搅拌式生物反应器能够提供良好的细胞生长环境,建立用于 hPDMCs 的大量扩增的体外三维培养体系.     

心肌再生医学的研究进展

心血管疾病是导致人类死亡的主要疾患之一, 其中以冠心病、心肌梗死最为常见。导致心功能衰竭的主要原因是心肌梗死后心肌细胞的大量丢失及内源性修复机制的缺失,受损的心肌被瘢痕组织所替代，从而进一步导致心功能的丧失。心脏移植可以治疗严重心功能衰竭，但这一有效治疗措施受供体来源和免疫排斥反应等的限制。近年来，随着人类对干细胞认识的加深，应用心肌再生治疗心血管疾病已经成为一个新的研究热点。     

人类脐血来源的间充质干细胞向软骨和成骨细胞分化的实验研究

取足月剖宫产健康新生儿脐血,应用密度梯度法分离脐血单个核细胞,利用形态学特点和流式细胞仪检测细胞表面标志,鉴定和获取间充质干细胞.应用软骨诱导剂(10 ng/ml TGF-β、100 ng/ml胰岛素、10-7 mol/L地塞米松、6.25 μg/ml转铁蛋白)和成骨诱导剂(10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μg/ml维生素C、10-7mol/L地塞米松)定向诱导分化培养,以检测其是否具有分化能力.脐血来源的间充质干细胞表达CD13、CD44、CD73、CD90、CD166、HLA-AB,不表达CD34、CD45、HLA-DR.诱导分化21 d后,甲苯胺蓝染色和von-Kossa染色均显示阳性,免疫细胞化学结果显示脐血来源干细胞经软骨诱导后表达Ⅱ型胶原.表明脐血中存在着间充质干细胞,可在体外扩增培养,具有分化成软骨细胞与成骨细胞的能力.     

细胞培养中枯草杆菌污染的防控

[目的]探讨青链霉素＋庆大霉素防控细胞培养中枯草杆菌污染的可行性。[方法]采用不同浓度青链霉素和庆大霉素配伍的方法，观察其抑制枯草杆菌的效果及对STO转基因小鼠滋养层细胞和D3系小鼠胚胎干细胞的生长情况的影响。[结果]700u／ml青链霉素和280u／ml庆大霉素联合应用的抑菌效果最佳，且对小鼠胚胎干细胞和小鼠成纤维细胞的生存率无明显影响。[结论]采用青链霉素和庆大霉素可以有效控制细胞培养中枯草杆菌的污染。     

STO转基因小鼠饲养层细胞的最佳预处理条件

目的:为保持胚胎干细胞的高度未分化状态,饲养层细胞成为胚胎干细胞体外培养中不可缺少的条件。本实验分析STO转染白血病抑制因子小鼠饲养层细胞的最佳预处理条件。方法:实验于2006-09/2006-11在中国医科大学病理生理学教研室完成。实验材料:DMEM、FBS、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青链霉素、β-巯基乙醇、丝裂霉素C均购于美国Sigma公司;STO转染白血病抑制因子小鼠饲养层细胞和D3系小鼠胚胎干细胞由日本信州大学惠赠。实验方法:将STO转基因小鼠饲养层细胞和D3系小鼠胚胎干细胞分别培养于10%DMEM中,其中含体积分数为0.1FBS、0.1mol/L非必需氨基酸、2mol/LL-谷氨酰胺、100u/mL青链霉素、0.1mol/Lβ-巯基乙醇。向10%DMEM中加入终浓度为100u/mL的白血病抑制因子,保持D3系小鼠胚胎干细胞的未分化状态。用6,10,20,30mg/L丝裂霉素C处理STO转基因细胞,同时设置未经丝裂霉素C处理的STO转基因细胞为对照。将经丝裂霉素C处理过的各组单细胞悬液分别以6×103,7×103,8×103,9×103,1×104,2×104,3×104,4×104,5×104,6×104/cm2细胞密度接种于12孔板内,培养过夜。次日取预处理效果最佳组的STO转基因细胞作为饲养层细胞培养D3系小鼠胚胎干细胞,将D3系小鼠胚胎干细胞以1×104/cm2接种于上述经过丝裂霉素C处理过的STO转基因细胞上,观察D3系小鼠胚胎干细胞附壁、增殖情况及有无分化。结果:①丝裂霉素C对STO转基因细胞生长的影响:不同质量浓度丝裂霉素C均能抑制STO转基因细胞增殖,其中6mg/L处理组STO转基因细胞虽有增殖能力,但较对照组增殖速度明显减慢,10mg/L以上处理组细胞数量不但没有增加,反而稍有下降。②丝裂霉素C对STO转基因细胞形态的影响:6mg/L丝裂霉素C处理组STO转基因细胞形态未见明显变化;10mg/L以上丝裂霉素C处理组STO转基因细胞,随着丝裂霉素C质量浓度的增加,形态变异逐渐明显,以星形细胞和裂解大泡居多。③饲养层细胞密度对胚胎干细胞培养的影响:本实验中10mg/L丝裂霉素C处理组预处理效果最佳,取该处理组作为饲养层培养D3系小鼠胚胎干细胞。次日于显微镜下观察,以不同细胞密度接种的饲养层培养的小鼠胚胎干细胞形态无明显差异,随着饲养层细胞接种密度的增加,形成的干细胞集落逐渐增多、增大,集落细胞排列逐渐紧密,以2×104/cm2密度饲养层组最佳。随着饲养层细胞密度的继续增加,形成的干细胞集落相对减少,集落细胞排列渐疏散。结论:10mg/L丝裂霉素C作用的STO转染白血病抑制因子细胞3h即可达到较好的处理效果,适宜STO转基因小鼠饲养层细胞的接种密度为2×104/cm2。     

发菜豆腐羹

主料:盒豆腐1块。辅料:发菜50克。调料:绍酒2克、胡椒粉1克、姜汁5克、味精1克、精盐5克、清汤1000克、淀粉15克。制作:嫩豆腐切细丝,并用开水略烫后备用;发菜用温水浸泡清洗。在汤锅     

丹参诱导pαMHC-EGFP小鼠转基因胚胎干细胞向心肌细胞分化的作用

目的:观察丹参对pαMHC-EGFP小鼠转基因胚胎干细胞向心肌细胞分化的诱导作用。方法:采用悬浮法,从拟胚体形成的第4、5、6、7d起在培养液中加入不同浓度的丹参诱导pαMHC-EGFP小鼠转基因胚胎干细胞向心肌细胞分化,计数第8、9、10、11、12d心肌细胞的分化率。用RT-PCR方法检测分化的心肌细胞αMHC、Anf、MLC2v基因的表达。结果:10、30、50、70mg/ml丹参在拟胚体形成的第10、11、12d均可明显提高心肌细胞的分化率(P<0.01)。RT-PCR结果αMHC、Anf、MLC2v基因在分化的心肌细胞中表达。结论:丹参可以体外提高pαMHC-EGFP小鼠转基因胚胎干细胞向心肌细胞的分化率。     

胎盘来源的间充质干细胞体外分离培养及向软骨细胞分化的研究

目的对人胎盘间充质干细胞体外分离培养及向软骨细胞分化进行研究,为软骨组织工程提供种子细胞。方法取人正常分娩后的胎盘,用组织块培养法分离获取胎盘间充质干细胞,对所获细胞进行体外培养和表面标志的流式细胞仪分析。对经过证实的骨髓间充质干细胞用含TGF-β_3、维生素C、胰岛素、地塞米松、转铁蛋白的诱导培养基处理7-28d,对诱导细胞进行甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原染色,鉴定诱导后的软骨细胞表型。结果培养的人胎盘间充质干细胞均一表达CD_(29)和CD_(44),而CD_(31)、CD_(34)、CD_(45)和HLA-DR呈阴性。细胞经诱导液作用14d后,甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原染色阳性。结论采用组织块培养法能分离获取高纯度的人胎盘间充质干细胞,该细胞经诱导液作用可定向分化为软骨细胞。     

小鼠心肌梗死后肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和白细胞介素10表达变化及心肌病理改变

目的探讨小鼠心肌梗死后血清细胞因子表达的变化与心肌炎症反应的关系。方法冠状动脉结扎法复制小鼠心肌梗死模型,采用ELISA方法测定结扎后不同时间点血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和白细胞介素10浓度和心肌组织病理变化。结果心肌梗死后1h,小鼠血清中肿瘤坏死因子α和白细胞介素10浓度分别是82.4±27.6ng/L和47.7±22.3ng/L,与假手术组水平(40.4±9.7ng/L和23.4±4.3ng/L)比较均明显提高,差异有统计学意义(P<0.05),以后呈逐渐下降趋势;血清中白细胞介素6水平在心肌梗死后1h、2h、4h、1d、2d和5d分别为202.7±89.5ng/L、578.9±198.0ng/L、696.8±104.7ng/L、325.1±131.7ng/L、218.5±16.0ng/L和195.8±93.1ng/L,与假手术组水平(54.0±3.0ng/L)比较均有显著增高(P<0.05),病理切片显示梗死心肌内大量的炎性细胞浸润。梗死后第2至4周细胞因子表达下降,梗死区炎症细胞逐渐减少,心肌纤维化。结论肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和白细胞介素10三种细胞因子参与了心肌梗死后心肌的炎症反应,在心肌梗死的发生发展过程中起重要作用。     

冬补三法

养生益寿：养生益寿者除了注意起居和调养精神外，冬补也很重要。冬补的方法有两种：一是食补，二是药补。冬补的药物有：人参、阿胶、鹿茸等。人参补气，对气虚、体弱、四肢无力、过度疲劳、头晕眼花、耳鸣等虚弱的人最为合适。阿胶是滋阴补血良药。具有补血止血、滋阴润燥的功能，适用于血虚眩晕、心悸失眠、虚劳咳嗽、便血等患者滋补调养。