99mTc标记c-erbB2反义寡脱氧核苷酸对乳腺癌显像的实验研究

用放射性核素标记癌基因反义寡脱氧核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides，ASODN）对肿瘤进行显像，可以探测只有癌基因激活、扩增和过度表达还没有形成实体的肿瘤组织，以实现对肿瘤的早期诊断。乳腺癌是妇女发病率和死亡率最高的主要恶性肿瘤，如果能在肿瘤早期鉴别其癌基因的表达类型及临床分期，施行“量体裁衣”式的治疗，可提高乳腺癌治疗的效果。c-erbB2是乳腺癌原癌基因，与乳腺癌的恶性转化和不良预后密切相关。     

环氧化酶抑制剂对人乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用研究

目的:研究环氧化酶抑制剂阿司匹林和选择性环氧化酶2抑制剂尼美舒利对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231的生长抑制作用,并初步探讨其作用机理.方法:用阿司匹林和尼美舒利分别作用人乳腺癌细胞株MDA-MB-231,MTT法观察其生长抑制作用;免疫组化法检测阿司匹林和尼美舒利作用后MDA-MB-231细胞中COX-2和c-erbB-2的表达情况.结果:阿司匹林和尼美舒利能够抑制MDA-MB-231细胞的生长,并呈时间-剂量依赖型.COX-2在MDA-MB-231细胞中表达呈阳性,免疫组化发现细胞内c-erbB-2表达下降.结论:环氧化酶抑制剂能够有效的抑制肿瘤细胞的生长,其机制可能与下调c-erbB-2基因的表达有关.     

人瘦素分离纯化的实验研究

背景：瘦素是脂肪组织产生的一种激素，具有广泛的生理作用，也是近年能量代谢研究的热点之一，所用瘦素主要是大肠杆菌的表达产物，后者以不溶解的包含体形式存在，需要通过烦琐的复性过程才能获得具有生物学活性的人瘦素。目的：为获得天然溶解形式的人瘦素．探索其非亲和层析纯化条件，为进一步可能的产业化提供依据。设计：实验观察。单位：一所医学院的生化教研室分子生物学实验室。材料：选择强阴离子交换剂(Sepharose Q)和疏水介质(Phenyl Sepharose 6)在不同条件下进行层析的方法，以尽可能除去样品中的杂质。方法：将培养获得的上清液在pH7．5的条件下首先经过Q柱柱层析纯化，收集目的蛋白；随后在高盐[mol／L(NH4)2SO4]状态下通过疏水层析进一步纯化。主要观察指标：经凝胶扫描分析，纯化前的培养上清液人瘦素纯度为42．3％，Q柱柱层析纯化后纯度达到89．6％，疏水层析进一步纯化后纯度达到96．2％。结果：纯化产物在SDS-PAGE上呈现单一条带。经凝胶扫描分析，纯化前的培养上清液人瘦素纯度为42．3％，Q柱柱层析纯化后纯度达到89．6％，疏水层析进一步纯化后纯度达到96．2％。结论：通过强阳离子交换层析和疏水层析的合并应用，可将毕赤酵母表达系统表达的人瘦素进行有效纯化，纯度可达镍柱亲和层析的纯化结果，为进一步可能的产业化生产人瘦素提供了可靠依据和方法，为围绕瘦素的相关领域研究奠定了实验学基础。     

RNA干扰bcl-2基因对人骨肉瘤细胞株MG63增殖影响的实验研究

目的 探讨RNA干扰bcl-2基因对人骨肉瘤细胞体外增殖及凋亡的调控作用.方法 选用人骨肉瘤细胞进行体外培养,以siRNA分别处理MG63细胞24～72h后,MTT法检测细胞增殖,SABC免疫组织化学法检测细胞内bcl-2、bcl-xl、bax、caspase-3和C-myc蛋白表达水平.结果 RNA干扰bcl-2基因对MG63细胞增殖有抑制作用.下调bcl-2的表达的同时,上调了caspase-3蛋白表达水平,并使C-myc蛋白表达水平下调.对bcl-xl、bax的蛋白表达无明显影响.结论 RNA干扰显著降低bcl-2蛋白的表达,对人骨肉瘤细胞的增殖具有明显的抑制作用.     

有双重活性的重组胸腺素α1与复合α干扰素融合蛋白的分离纯化

背景: 研究表明,将干扰素与胸腺素α1联合应用可增强干扰素的抗病毒作用。 目的：获得既具有干扰素抗病毒活性又有胸腺素α1增强免疫功能的双重活性重组融合蛋白。 设计、时间及地点：体外对比试验,于2003-03/2004-12在重庆康尔威药业股份有限公司药物研究所完成。 材料：融合基因片断由上海生工合成,人羊膜细胞、水泡性口炎病毒购自上海生化与细胞生物所,对照品IFNα1b、IFNα2a和胸腺素α1为市售药品。 方法：选择大肠杆菌偏爱的密码子,将合成的胸腺素α1与复合干扰素编码序列构成的融和基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-22b(+)、在宿主菌BL21(DE3)-Codon plus-RP-X中表达融合蛋白。通过硫酸铵沉淀、疏水层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析、分子筛层析等方法进行分离纯化。采用细胞病变抑制法测定融合蛋白的抗病毒活性,采用细胞增殖实验检测融合蛋白对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。 主要观察指标：重组融合蛋白抗病毒的活性和促小鼠脾淋巴细胞增殖活性。 结果：①在大肠杆菌中表达的融合蛋白呈胞内可溶性表达,表达量占细菌总蛋白的20%以上。②纯化后,融合蛋白的纯度达96%以上。③融合蛋白的抗病毒活性优于市售的IFNα1b、IFNα2a。④融合蛋白的促淋巴细胞增殖活性与市售胸腺素α1相似。 结论：在大肠杆菌中表达的胸腺素α1与复合干扰素融合蛋白既具有干扰素抗病毒活性又有胸腺素α1的增强免疫功能。     

~(99m)Tc-ASODN-EGF的小鼠体内分布和兔药动学

目的:研究c-erbB2反义寡脱氧核苷酸(ASODN)探针99mTc-ASODN-EGF的体内分布和药动学特性。方法:小鼠尾静脉注射99mTc-ASODN-EGF 370 kBq(10μC i).150μL-1,于0.5,1,2,4,8,24 h取血、肝、脾、肾等组织器官,测定每分钟放射性计数(cpm),并准确称重,计算每克组织百分注射剂量率(%ID.g-1)。兔经左侧耳缘静脉注射99mTc-ASODN-EGF 1110 kBq(30μC i).2 mL-1,于1,3,5,10,15,20,25,30,40,60,120,240,360 m in从右侧耳缘静脉采血约0.2 mL,测定cpm,准确称重,计算每克血液每分钟放射性计数,用3P97软件计算药动学参数。结果:99mTc-ASODN-EGF在小鼠肝、肾、脾和肺的放射性分布较高,1 h的%ID.g-1分别为22±8,7.4±2.0,46±28和13±7。在心、脑、骨和肌肉的放射性分布很低。兔药动学参数符合二室模型,t12α为(0.32±0.07)h,t12β为(9±3)h,Vc为(1.2±0.8)cpm.kg-1,Cl为(0.061±0.023)cpm.h-1。结论:99mTc-ASODN-EGF的组织器官分布和药动学特性能满足临床显像的要求,可用于肿瘤靶基因的显像。     

靶向Bcl-2基因转录shRNA重组质粒的构建和序列分析

[目的]利用RNA干扰技术,以Bcl-2为靶基因,设计构建重组体,并进行序列分析,探索肿瘤基因治疗的新途径。[方法]设计有小发夹结构的两条DNA序列,经退火形成互补双链,克隆至转录载体Pgenesil-1上构建重组体,转化DH5a菌株,提取质粒行酶切鉴定后,进行测序分析。[结果]将合成的DNA片段退火后克隆至载体上,经酶切及序列鉴定为目的序列,靶向Bcl-2基因转录shRNA重组质粒构建成功。[结论]靶向Bcl-2基因转录shRNA重组质粒的成功构建,为下一步利用该重组体干扰肿瘤细胞中Bcl-2的mRNA转录,探索肿瘤基因治疗的新途径奠定基础。     

环氧化酶2抑制剂尼美舒利对乳腺癌细胞株放射敏感性的影响

[目的]探讨环氧化酶2抑制剂尼美舒利对乳腺癌细胞株MCF-7放射增敏作用并初步探讨其机制.[方法]克隆形成实验检测尼美舒利对MCF-7放射增敏作用;电镜观察肿瘤细胞形态学改变;流武细胞仪(FCM)检测肿瘤细胞调亡率及Bcl-2、Bax蛋白表达. [结果]不同浓度尼美舒利对乳腺癌细胞MCF-7均有放射增敏作用,且呈剂量依赖性关系;尼美舒利与射线照射联用能够上调Bax蛋白表达,同时抑制Bel-2蛋白表达,明显增加细胞凋亡率. [结论]COX2抑制剂尼美舒利对人乳腺癌MCF-7细胞株具有明显放疗增敏作用.     

RNAi表达载体对卵巢癌Bcl-2基因表达的抑制作用

目的:探讨Bcl-2基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)表达载体对卵巢癌SKOV3细胞Bcl-2基因表达的抑制作用。方法:构建针对Bcl-2基因的RNAi表达载体,脂质体法转染卵巢癌SKOV3细胞株,应用RT-PCR及流式细胞仪检测其对Bcl-2基因mRNA及蛋白表达的影响。结果:构建的两种表达载体均抑制了Bcl-2基因的mRNA及蛋白的表达,其中转染2号载体的SKOV3细胞Bcl-2基因mRNA表达仅相当于对照组的32.3%,蛋白抑制率达60.18%。结论:RNAi表达载体可以有效抑制Bcl-2基因的表达。