Lipofectamine TM2000介导pIRES2-EGFP-NT3转染新生小鼠离体耳蜗基底膜的实验研究

目的构建真核表达质粒载体pIRES2-EGFP-NT3,检测其在阳离子脂质体介导下对新生小鼠离体耳蜗基底膜的转染情况。方法构建含有目的基因NT3的真核表达质粒载体pIRES2-EGFP-NT3后,在阳离子脂质体LipofectamineTM2000介导下将其转染新生小鼠离体耳蜗基底膜培养组织,转染后24 h,通过Confocal显微镜观察小鼠离体耳蜗基底膜的转染情况和转染效率。结果成功构建了真核表达质粒载体pIRES2-EGFP-NT3,通过阳离子脂质体LipofectamineTM2000介导,该质粒在新生小鼠离体耳蜗基底膜转染的范围内转染进17个细胞,说明该质粒在阳离子脂质体介导下能转染新生小鼠离体耳蜗基底膜培养组织。结论含有目的基因NT3的真核表达质粒载体pIRES2-EGFP-NT3的成功构建,及其在阳离子脂质体介导下对新生小鼠离体耳蜗基底膜培养组织的有效转染,为研究NT3基因转染对正常及致聋小鼠耳蜗效应的实验奠定了基础。     

Ad-DsRed2-NT3转染小鼠离体耳蜗基底膜预防庆大霉素耳毒性的实验研究

目的将含有目的基因NT3的重组腺病毒Ad-DsRed2-NT3转染新生小鼠的离体耳蜗基底膜培养组织,观察其在预防庆大霉素的耳毒性中的作用。方法取新生小鼠的耳蜗基底膜离体培养1d后,用含有目的基因NT3的重组腺病毒Ad-DsRed2-NT3转染新生小鼠的离体耳蜗基底膜培养组织,转染成功1d后用终浓度为3mM的庆大霉素对离体耳蜗基底膜造模,造模3d后,行离体耳蜗基底膜的神经微丝免疫荧光染色,观察各组耳蜗基底膜神经微丝的密度,以观测NT3对离体耳蜗基底膜上的螺旋神经的保护作用。结果新生小鼠的离体耳蜗基底膜生长良好,重组腺病毒Ad-DsRed2-NT3能对其有效转染,庆大霉素造模后3d各组耳蜗基底膜神经微丝的密度(每100μm距离内的螺旋神经微丝数)分别为(±s):造模组16.67±1.63、Ad-DsRed2组16.17±2.31、Ad-DsRed2-NT3组40.33±1.63、空白组为43.17±0.75,其中,造模组与空白组、Ad-DsRed2-NT3组与造模组、Ad-DsRed2-NT3组与Ad-DsRed2组之间具有显著性统计学差异(P<0.05)。结论终浓度为3mM的庆大霉素对小鼠离体耳蜗基底膜上的螺旋神经有明显的损害作用,而NT3基因的过表达对这种损害具有保护作用。     

携带神经营养因子-3基因的重组腺病毒的构建和鉴定

目的:构建含人神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)的重组腺病毒载体,为初步研究NT-3的在体功能做准备。方法:酶切法从已构建好的真核表达载体NT-3-pIRES2-DsRed2质粒中切下含有NT-3和DsRed2(包括连接区域pIRES2)的目的片段,将其插入到腺病毒骨架质粒pAdShuttle-CMV的多克隆位点中,电穿孔法将腺病毒骨架载体pAdShuttle-CMV-NT-3-DsRed2和预转入人肠杆菌BJ5183的穿梭载体pAdEasy-1进行细菌内同源重组。PacⅠ酶切线性化鉴定正确的同源重组载体,脂质体法转染293T细胞,包装形成表达NT-3目的蛋白和红色荧光的腺病毒。通过293T细胞3轮扩增病毒,氯化铯密度梯度离心,获得高滴度的纯化腺病毒。Western blot方法检测蛋白表达情况。结果:同源重组质粒载体的DNA测序证实腺病毒载体中含有NT-3的目的片段,Western blot证实感染重组腺病毒的293T细胞中有相应的NT-3蛋白表达;病毒滴度为109PFU/ml。结论:利用细菌内同源重组的方法可以成功构建同时表达NT-3蛋白和红色荧光的重组腺病毒。     

喉癌组织中细胞黏附分子的表达及其预后评估价值

目的:研究喉癌组织中细胞黏附分子E-钙黏附素（ECD）的表达及其在喉癌患者临床预后的评估价值。方法:应用组织芯片及免疫组织化学EnVision二步法检测ECD在79例喉癌切除标本组织中的表达情况,并结合临床随访,分析其与临床病理特征及患者预后的关系。结果:ECD在79例喉癌中阴性表达11例（13.3%）,ECD的表达在喉癌患者的各临床病理特征间差异均无统计学意义（P>0.05）。病死患者ECD表达阳性率为76.74%,生存患者ECD表达阳性率为94.44%,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:ECD的分析对于评估临床预后有重要参考价值。     

真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1的构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的构建真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1,并验证其在HEK293T细胞中的表达。方法从人的全血标本中提取DNA模板,经PCR获得Hath1-cDNA,将Hath1-cDNA和pIRES2-DsRed2质粒用限制性内切酶XhoⅠ、EcoRⅠ双酶切,酶切产物琼脂糖凝胶电泳,割胶纯化,前者回收1065bp片断,后者回收大片断,再将回收的2个片断用T4DNA连接酶连接,转化感受态DH5α细胞,挑选单克隆,提取质粒,将所提取的质粒双酶切鉴定并测序。再将构建成功的pIRES2-DsRed2-Hath1质粒通过脂质体LipofectamineTM2000转染HEK293T细胞,观测其转染情况和目的基因的表达情况。结果成功地构建了真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1,该质粒能有效地转染HEK293T细胞,目的基因能有效表达。结论pIRES2-DsRed2-Hath1的构建为Hath1基因转染致聋小鼠的耳蜗的实验奠定了基础。     

真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1的构建及其在HEK293T细胞中的表达术

目的构建真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1，并验证其在HEK293T细胞中的表达。方法从人的全血标本中提取DNA模板，经PCR获得Hath1-cDNA，将Hath1-cDNA和pIRES2-DsRed2质粒用限制性内切酶XhoI、EcoRI双酶切，酶切产物琼脂糖凝胶电泳，割胶纯化，前者回收1065bp片断，后者回收大片断，再将回收的2个片断用T4DNA连接酶连接，转化感受态DH5q细胞，挑选单克隆，提取质粒，将所提取的质粒双酶切鉴定并测序。再将构建成功的pIRES2-DsRed2-Hath1质粒通过脂质体Lipofectarnine^TM2000转染HEK293T细胞，观测其转染情况和目的基因的表达情况。结果成功地构建了真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1，该质粒能有效地转染HEK293T细胞，目的基因能有效表达。结论pIRES2-DsRed2-Hath1的构建为Hath1基因转染致聋小鼠的耳蜗的实验奠定了基础。     

成人分泌性中耳炎所致骨导听力下降的初步研究

目的:初步研究成人分泌性中耳炎(OME)所致的骨导听力下降.方法:2009-03-2010-02间收集的成人OME 50例,比较51耳中耳穿刺抽液前、后骨导听阈变化;单耳发病对耳健康者,将患耳穿刺前骨导听阈和健耳进行比较24例,穿刺后骨导与健耳比较22例,痊愈后骨导与健耳比较9例,痊愈后高频、超高频与健耳比较4例.结果:中耳穿刺抽出中耳积液后骨导听力在各频(0.5、1.0、2.0、4.0 kHz)均明显提高,4.0 kHz最显著;单耳发病对耳健康者2耳比较,穿刺前患耳骨导听力(0.5~4.0 kHz)下降,穿刺和痊愈后多数可以恢复至健耳水平;4例中有3例患耳痊愈后的高频、超高频(8、10、12、16 kHz)与健耳相比听力下降.结论:OME的中耳积液和内耳损伤均可引起骨导听力下降,但0.5~4.0 kHz频区的骨导听力下降多由中耳积液所致,内耳损伤早期主要表现为高频、超高频区的听力下降,随病程延长可向较低频区发展.     

鼓室置管灌注甲泼尼龙治疗难治性梅尼埃病的疗效观察

目的:探讨鼓室置管灌注甲泼尼龙治疗难治性梅尼埃病(MD)的临床疗效.方法:回顾性分析2008-01-2010-01在南京大学医学院附属鼓楼医院住院的10例难治性MD患者,行患侧鼓室内置管灌注甲泼尼龙的疗效.随访(15.4±5.4)个月.根据MD诊断依据及疗效评估分级标准判定眩晕、听力及活动能力的治疗效果,依据耳鸣致残量表分析耳鸣的治疗效果.结果:7例患者眩晕完全控制(A级),2例患者分别于灌注后9、11个月复发眩晕(B级),但发作频率、眩晕程度、持续时间较前明显减轻,1例患者于灌注后18个月复发,眩晕程度较前无明显减轻(C级).2例患者纯音听阈改善达A级,4例患者听力较前提高达B级,4例患者听力较前无明显变化(C级).10例患者活动能力完全改善(A级).灌注前患者THI得分为48.80±7.25,灌注后患者THI得分为41.90±7.78.无一例发生不可愈合的鼓膜穿孔.结论:鼓室置管灌注甲泼尼龙能有效控制MD患者的眩晕、耳鸣,改善部分患者的听力.对于常规饮食控制及药物治疗无效的MD患者,选择鼓室置管灌注甲泼尼龙是创伤小、安全、有效的治疗方法.     

中耳胆脂瘤患者手术方式选择与术后疗效分析

目的：通过对比不同手术方式的中耳胆脂瘤患者术后疗效,总结中耳胆脂瘤的手术方式及经验。方法回顾性分析手术并随访的中耳胆脂瘤患者的资料,按照不同手术方式分成三组,即A组（乳突根治术）、B组（开放式乳突切开＋鼓室成形术）、C组（完壁式乳突切开＋鼓室成形术）,分析比较各组患者术后干耳时间、手术前后患者听力变化及手术前后耳鸣、眩晕等情况。结果 B组干耳时间较A组短,C组较A组干耳时间短,C组较B组干耳时间短,每组间两两比较差异有统计学意义。术后半年听力结果提示A组患者听力与术前比较差异无统计学意义,B组、C组较术前均有提高,差异有统计学意义。将三组患者术后气骨导差值两两比较,B组与A组的差异有统计学意义,C组与A组的差异有统计学意义,B组与C组的差异无统计学意义。三组手术前均有部分患者伴随耳鸣症状,手术后耳鸣残疾量表（ THI）评分均较术前下降,A组手术前后THI值差异无统计学意义,B组、C组差异有统计学意义。 A组、B组术前有部分患者伴随眩晕症状,两组手术后眩晕致残量表评分较术前均有下降,差异有统计学意义。结论中耳胆脂瘤患者各种手术治疗后均可有效去除病灶,实现干耳,改善眩晕。与乳突根治术相比,开放式乳突切开术＋鼓室成形术和完壁式乳突切开术＋鼓室成形术可以缩短术后干耳时间、提高患者术后听力,减轻耳鸣症状。     

PET滤膜用于承载耳蜗基底膜培养的实验研究

目的探讨一种适宜耳蜗组织贴壁培养的方法。方法 PET滤膜预先置入层粘连蛋白、鸟氨酸、胎牛血清按2:2:1比例混合均匀的液体中在4℃预孵过夜,选取出生四天的C57BL/6J小鼠作为研究对象。剥取基底膜以PET滤膜作为承载介质培养在加入含青霉素的培液中,48小时后收取样本,进行免疫荧光(一抗goat anti-otoancorin、mouse anti-beta tubu-linⅢ及对应二抗采用cy3 donkey anti goat,647 donkey anti mouse,染核试剂DAPI,phalloidin)观察不同部位细胞,扫描电镜及制备原位超薄切片透射电镜观察体外培养新生小鼠基底膜内外毛细胞、螺旋缘内细胞、螺旋神经元细胞显微结构的改变。结果耳蜗基底膜在PET膜上贴附生长良好。各种细胞的微小结构和超微结构保持正常状态。结论 PET滤膜能作为一种新颖的承载基底膜培养的介质。