苦参碱立方液晶纳米粒的制备及质量控制的研究

目的采用改良的高压均质法制备苦参碱立方液晶纳米粒,并建立其质量控制方法。方法以单油酸甘油酯(GMO)为载体材料,洛泊沙姆(F127)为稳定剂,通过高速剪切和超声粉碎制备立方液晶纳米粒。采用高效液相色谱法测定苦参碱的含量。结果苦参碱检测浓度在11.125~178μg/m L范围内,浓度和峰面积线性关系良好。苦参碱立方液晶纳米粒在3个浓度水平下测得的平均回收率分别为102.1%、102.6%、100.5%,RSD分别为1.9%、1.9%、2.1%(n=3);包封率为68%,RSD为2%;实验方法精密度良好。结论该制备工艺简单易行,质量控制方法简单、准确。     

深圳市2013年门诊结核病人流行病学调查分析

目的了解深圳市门诊结核病流行情况,分析现有临床检查对于在临床结核诊断中的应用情况。方法收集深圳市第三人民医院2013年1月至2013年12月就诊肺科门诊的病人的各项检查结果资料,回顾性分析各项诊断指标对结核病人诊断中的实际应用价值和效果。结果 2013年深圳市第三人民门诊病人为7726例,门诊诊断为结核病4378,阳性率为56.5%。其中3842例诊断为肺结核病人,各项检查结果阳性率分别为:痰培养27.2%,痰涂片10.6%,结核杆菌PCR 18.8%,结核杆菌抗体测定58.3%,IFNγELISPOT检测53.2%。536例诊断为肺外结核确诊病人,各项检查结果阳性率分别为:痰培养21%,痰涂片7.6%,结核杆菌PCR 13.8%,结核杆菌抗体测定62.2%,IFNγELISPOT检测63.1%。肺外结核病人中,按不同感染部位进行分类,结核杆菌抗体测定和IFN-γElispot检测仍然有较高的检出率。结论各项实验室检查只能为医生对结核病诊断提供一个参考初筛。面对大量门诊病人和各种疾病,还需要医生结合病情作出诊断。     

SLC7A11基因表达沉默的肝癌细胞株的构建及筛选

目的:构建并筛选出SLC7A11基因表达沉默的肝癌LM3细胞株,为研究SLC7A11基因的表达沉默对肝癌发生发展的影响奠定基础。方法:针对SLC7A11基因的不同部位合成3个siRNA的寡核苷酸片段,分别将其克隆到真核表达载体p GPU6/GFP/Neo中。利用脂质体转染法分别将质粒导入肝癌LM3细胞,24小时后观察细胞内GFP表达情况,并通过real-time PCR及Western blot的方法比较各组细胞SLC7A11基因mRNA和蛋白的表达水平,然后用G418对转染细胞进行筛选培养。结果:经酶切分析及测序验证,成功构建了靶向沉默SLC7A11基因的真核表达质粒p GPU6-SLC7A11-siRNA;通过real-time PCR及Western blot的方法验证,成功筛选出SLC7A11基因表达沉默的肝癌LM3细胞株。结论:成功构建并筛选出SLC7A11基因表达沉默的肝癌细胞株,为进一步研究SLC7A11基因表达沉默对肝癌细胞发生发展的影响奠定了基础。     

氨基葡萄糖对人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响

目的:研究氨基葡萄糖对人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响,并初步探讨其分子机制。方法:CCK-8法检测人肝癌HepG2细胞的增殖情况。流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡。Western blot检测ERK及P-ERK蛋白的表达水平。结果:氨基葡萄糖可以抑制人肝癌HepG2细胞的增殖,且该作用随着药物浓度的增加而逐渐增强。1.0mmol/L氨基葡萄糖作用72h可以使G0/G1期细胞比例增加,S期细胞比例降低。同时,2.0mmol/L及4.0mmol/L氨基葡萄糖处理72h可以使人肝癌HepG2细胞发生凋亡。另外,随着药物浓度的增加,人肝癌HepG2细胞中ERK蛋白的磷酸化水平逐渐降低。结论:氨基葡萄糖可能是通过降低ERK1/2蛋白的磷酸化水平影响细胞周期,从而抑制人肝癌HepG2细胞的增殖并诱导其发生凋亡。     

结核患者血浆和胸水上清C1qC的表达水平的研究

目的利用酶联免疫吸附(ELISA)技术检测不同人群血浆中C1qC的蛋白表达水平以及结核病人胸水和血浆C1qC的蛋白表达水平。通过比较C1qC在不同人群和不同标本中的表达情况,评价其在结核诊断中的应用价值。方法利用ELISA技术分别对20例健康对照(HC)、20例结核潜伏感染者(LTBI)和27例肺结核病人(TB)血浆C1qC的表达水平;随访其中10例抗结核治疗的结核病人,检测其血浆中C1qC的表达,观察在抗结核治疗过程中(抗结核治疗前、抗治疗3个月和6个月)C1q C的表达水平;检测16例结核性胸膜炎病人配对的血浆和胸水上清中C1qC的表达水平,比较不同样本中C1qC的表达水平。结果 C1qC在结核健康对照、潜伏感染者、结核病人血浆中的表达水平分别为603.8±134.3、507.0±141.2、756.6±261.2(pg/mL)。肺结核病人C1qC的表达水平显著高于健康对照(P0.05)和潜伏感染者(P0.001);在10例结核病人中,C1qC在抗结核治疗前的表达水平为769.6±398.8(pg/mL),抗结核治疗3个月和6个月后C1q C表达分别为624.4±208.5和444.8±163.8(pg/mL),在抗结核治疗6个月后C1qC的表达水平显著地低于抗结核治疗前的水平(P0.05);C1qC在胸水上清中的表达水平显著高于血浆中的表达水平(P0.05)。结论 C1qC在结核患者的血浆中高表达,在抗结核治疗中逐渐下降,并且在结核感染部位表达显著增高。这些结果提示利用ELISA检测血浆和胸水上清中C1q C的表达可用于肺结核的辅助诊断。     

BLCAP基因RNA过编辑对肝癌细胞增殖的影响

目的研究BLCAP基因RNA过编辑对肝癌SMMC7721、Focus细胞的生长增殖能力的影响,并探讨其在肝癌发生发展的作用。方法采用半定量PCR的方法分析BLCAP基因在11株肝癌细胞以及2株正常肝脏细胞中的表达情况,选出2株BLCAP基因相对低表达的肝癌细胞株。以基因转染技术,将空质粒(pc DNA3.1,对照组)、BLCAP_WT(野生型)和BLCAP_RDD(过编辑型)质粒(实验组)分别转染肝癌细胞株,通过Western blot法检验转染效率。利用CCK-8生长曲线试验和平板克隆形成实验检测肝癌细胞株的增殖能力。结果半定量PCR结果显示BLCAP基因在肝癌SMMC7721、Focus细胞中的表达量相对较低。Western blot的结果显示,实验组细胞BLCAP基因的蛋白表达水平较对照组细胞明显增高(P0.05),表明转染较成功。CCK-8生长曲线试验和平板克隆形成实验的结果显示,肝癌SMMC7721和Focus细胞在转染BLCAP_RDD质粒后,其增殖能力较空质粒对照组及BLCAP_WT组细胞明显增强(P0.05)。结论 BLCAP基因过编辑可促进肝癌SMMC7721和Focus细胞的增殖,提示其在肝癌细胞中的过编辑与肝癌的发生发展密切相关。     

新发A20单倍剂量不足一例临床表型及免疫功能研究

目的探讨A20单倍剂量不足(HA20)患儿的临床特征、肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(TNFAIP3)基因突变特点、免疫表型及免疫学致病机制。方法回顾性分析2019年5月深圳市儿童医院收治的1例TNFAIP3基因突变所致HA20患儿的临床特征;运用流式细胞术进行患儿外周血精细淋巴细胞分型检测以及患儿和13名健康对照滤泡辅助性T细胞(TFH)比例检测;构建空载体、野生型及突变型质粒载体;在293T和Hela细胞系中建立TNFAIP3基因野生型或突变体过表达体系,分别检测A20蛋白和肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激前后绿色荧光蛋白(GFP)阳性Hela细胞中抑制性卡巴蛋白α(IKBα)表达水平,以验证该变异位点的致病性。结果患儿男,5岁11月龄,以反复口腔溃疡、腹痛、关节肿痛为主要表现,阳性体征包括口腔溃疡、双下肢暗红色陈旧性皮疹、双膝关节肿胀伴压痛,疾病活动期时炎症指标升高,肠镜显示回肠末及回盲部黏膜充血肿胀,见多发溃疡;基因测序分析显示TNFAIP3基因杂合突变[c.909_913 del(p.L303fs)];外周血淋巴细胞精细分型显示初始B细胞124×106个/L(参考范围147×106~431×106个/L),占总B细胞的0.430(参考范围0.484~0.758);TFH占CD4+T细胞0.008(健康对照组范围为0.016~0.071)。体外实验显示突变体过表达293T和Hela细胞中均存在A20截短型蛋白表达,TNF-α刺激后TNFAIP3基因野生型过表达组IkBα蛋白降解率为15%,空载体过表达组Hela细胞中IkBα蛋白降解率较高,为57%,而突变体过表达组IkBα蛋白降解率介于两组之间,为35%。结论该HA20患儿以早发性白塞病样自身炎症反应综合征为主要临床特征,存在TNFAIP3基因新发移码突变。该突变引起A20截短型蛋白表达和剂量相对不足,导致IkBα蛋白降解增加,核因子κB信号通路活化增强。     

CENPK基因过表达载体的构建及鉴定

[目的]构建着丝粒蛋白K (cetromere protein K,CENPK)基因过表达载体,并对其在肝癌FOCUS细胞中的表达进行鉴定.[方法]①从人肝癌组织中扩增出CENPK目的基因并将其克隆到pCMV-3Tag-3载体上,构建真核表达载体pCMV-CENPK;②利用脂质体法将构建好的pCMV-CENPK真核表达载体转染肝癌FOCUS细胞,并用G418筛选出CENPK基因稳定过表达的肝癌FOCUS细胞株;(③通过Real-time PCR及Western Blot的方法对筛选出来的细胞进行鉴定.[结果]①经双酶切分析及测序验证,成功构建了真核表达载体pCMV-CENPK.②通过Real-time PCR及Western blot的方法鉴定,CENPK基因在筛选出来的肝癌FOCUS细胞株中成功过表达.[结论]成功构建真核表达载体pCMV-CENPK并使其在肝癌FOCUS细胞中稳定过表达,为进一步研究CENPK基因在肝癌发生发展中的作用奠定了基础.     

结核γ-干扰素酶联免疫斑点检测在结核性心包积液诊断中的应用

目的 探讨结核菌特异性γ-干扰素（interferon-gamma,IFN-γ）酶联免疫斑点（enzyme-linked immunosorbent spot,ELISPOT）检测对结核性心包积液的诊断价值.方法 采用结核菌特异性IFN-γ ELISPOT技术同时检测20例结核性心包积液患者（TP组）和14例非结核性心包积液患者（Non-TP组）外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）及心包积液单核细胞（pleural effusion mononuclear cells,PEMC）中结核菌特异性IFN-γ水平.结果 TP组PBMC和PEMC结核菌特异性IFN-γ水平均显著高于Non-TP组,差异有统计学意义（P＜0.01,P＜0.01）.TP组心包积液中结核菌特异性IFN-y水平显著高于外周血IFN-γ水平,差异有统计学意义（P＜0.01,P＜0.01）.PBMC ELISPOT检测结核性心包积液的敏感性和特异性分别为80.0％和85.7％;而PEMC ELISPOT敏感性和特异性为90.0％和85.7％.结论 结核菌特异性IFN-γELISPOT技术对结核性心包积液诊断和鉴别诊断具有很好的辅助价值.