肿瘤坏死因子-α在前列腺癌组织中的表达及临床意义

目的检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在前列腺癌组织中的表达,探讨其与前列腺癌临床病理特征和肿瘤血管生成的关系。方法采用免疫组织化学二步法检测2010年1月-2012年1月20例前列腺增生组织、50例前列腺癌组织中TNF-α蛋白和CD105的表达情况,并计数CD105标记的微血管密度(MVD)。结果免疫组织化学结果显示TNF-α在前列腺癌组织的肿瘤细胞膜及细胞质中表达较高(41.72±8.67),而在前列腺增生组织中表达较低(21.01±3.85),差异有统计学意义(t’=13.990,P<0.001);CD105在前列腺癌中阳性染色定位于肿瘤微血管内皮细胞膜表达较高(20.15±2.67),而在前列腺增生组织中表达较低(4.34±1.67),差异有统计学意义(t’=29.771,P<0.001)。TNF-α和CD105的表达与患者年龄、肿瘤大小无关,与前列腺癌的临床分期呈正相关(rs=0.847,P<0.001;rs=0.776,P<0.001),与病理分级呈负相关(rs=-0.769,P<0.001;rs=-0.842,P<0.001)。结论前列腺癌组织中存在TNF-α的高表达,其可能在前列腺癌的血管生成和肿瘤的发生、发展中起重要作用。     

自噬在高糖条件下视网膜色素上皮细胞表达血管内皮生长因子促进RF/6A细胞血管生成中的作用

目的　研究高糖条件下诱导的人视网膜色素上皮细胞株（ARPE-19）自噬对其表达血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），及恒河猴脉络膜视网膜血管内皮细胞（RF/6A）迁移和管腔形成的影响。方法　根据不同干预将ARPE-19细胞随机分为对照组、高糖组及3-甲基腺嘌呤（3-MA）+高糖组。对照组细胞在无糖DMEM培养基中常规培养24 h，高糖组细胞在DMEM培养基中加入30 mmol·L^-1葡萄糖溶液处理24 h，3-MA+高糖组细胞先用10 mmol·L^-1 3-MA处理24 h，然后更换培养基再加入30 mmol·L^-1葡萄糖溶液处理24 h。Western blot法检测细胞自噬标志性蛋白微管相关蛋白1 轻链 3（microtubule-related protein 1 light chain 3，LC3）II型和I型的比值(LC3-II/LC3-I)、Beclin-1及细胞中自噬相关基因3（autophagy-related gene 3，Atg3）的蛋白表达。ELISA法检测ARPE-19细胞上清液中VEGF的蛋白表达。比较三组ARPE-19细胞LC3-II/LC3-I、Beclin-1、Atg3及VEGF的蛋白表达量。然后将以上三组ARPE-19细胞上清液分别加入RF/6A细胞培养基中，将RF/6A细胞也按以上方法分组，分别采用Transwell法及Matrigel胶法检测并比较三组RF/6A细胞迁移数及细胞管腔形成数。结果　对照组、高糖组和3-MA+高糖组ARPE-19细胞中LC3-II/LC3-I比值分别为0.405±0.095、0.932±0.024和0.635±0.048；Beclin-1蛋白相对表达量分别为0.205±0.035、0.590±0.120和0.425±0.082；Atg3蛋白相对表达量分别为0.277±0.035、0.539±0.071和0.389±0.019。ARPE-19细胞上清液中VEGF的蛋白表达量三组分别为（44.03±9.08）ng·L^-1、（205.70±17.90）ng·L^-1和（112.52±21.06）ng·L^-1；RF/6A细胞迁移数三组分别为（125.60±6.35）个、（153.60±19.20）个和（67.40±7.95）个；细胞管腔形成数三组分别为（12.22±0.84）个、（18.44±1.68）个和（5.44±0.51）个；整体比较差异均有统计学意义（均为P<0.01）。与对照组相比，高糖组ARPE-19细胞的LC3-II/LC3-I比值、Beclin-1及Atg3蛋白相对表达量均明显增加（均为P<0.01），VEGF表达水平均明显升高（P<0.01），RF/6A细胞迁移数和管腔形成数均明显增加（均为P<0.01），3-MA+高糖组ARPE-19细胞中LC3-II/I比值、Beclin-1和Atg3蛋白相对表达量、VEGF表达量、RF/6A细胞迁移数和细胞管腔形成数均较高糖组明显降低（均为P<0.01）。结论　高糖激活ARPE-19细胞自噬，进而上调VEGF的表达并促进RF/6A细胞迁移和管腔形成，自噬抑制剂3-MA可抑制ARPE-19细胞自噬，并下调VEGF的表达从而抑制RF/6A细胞的血管形成能力。     

自噬抑制剂3-MA对缺氧诱导的人视网膜色素上皮细胞表达TNF-α的抑制作用

目的研究自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对缺氧条件下人视网膜色素上皮(RPE)细胞表达肿瘤坏死因子α(TNF-α)的影响。方法将体外培养的ARPE-19细胞随机分为对照组、缺氧组和3-MA+缺氧组,对照组细胞在常氧条件下培养,缺氧组细胞在缺氧箱(1%O2/5%CO2/94%N2)中进行培养,3-MA+缺氧组先在培养基中加入10 m M 3-MA,然后置于缺氧箱中继续培养。采用Western blot法检测各组细胞的自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3 B (LC3B)、Beclin-1及p62的表达;采用ELISA法检测各组细胞上清液中TNF-α的浓度。结果 (1)对照组、缺氧组、3-MA+缺氧组细胞的TNF-α浓度分别为(59. 46±5. 22) pg/ml、(135. 80±11. 30) pg/ml和(105. 88±10. 42) pg/ml,总体比较差异有统计学意义(F=50. 53,P=0. 000),缺氧组的TNF-α浓度明显高于对照组和3-MA+缺氧组,差异均有统计学意义(均P <0. 01),3-MA+缺氧组的TNF-α浓度高于对照组,差异有统计学意义(P <0. 01)。(2)对照组、缺氧组、3-MA+缺氧组细胞中的LC3B-II/LC3B-I值、Beclin-1值及p62值分别为(0. 20±0. 03、0. 58±0. 07和0. 40±0. 09)、(0. 32±0. 04、0. 97±0. 05和0. 78±0. 06)和(1. 03±0. 02、0. 32±0. 10和0. 78±0. 08),组间总体比较差异均有统计学意义(LC3B-II/LC3B-I:F=21. 73,P=0. 002; Beclin-1:F=149. 34,P=0. 000; p62:F=69. 53,P=0. 000)。缺氧组细胞中LC3B-II/LC3B-I值和Beclin-1值均明显高于对照组和3-MA+缺氧组,差异均有统计学意义(均P <0. 05),3-MA+缺氧组的LC3B-II/LC3B-I值和Beclin-1值均高于对照组,差异均有统计学意义(均P <0. 05)。缺氧组细胞中p62值明显低于对照组和3-MA+缺氧组,差异均有统计学意义(均P <0. 01),3-MA+缺氧组的p62值低于对照组,差异有统计学意义(P <0. 01)。结论缺氧激活RPE细胞自噬并促进其TNF-α的表达,自噬抑制剂3-MA可在一定程度上抑制自噬进程,从而发挥抑制细胞表达TNF-α的作用。     

槲皮素干预下HBx基因对人肝癌细胞侵袭、迁移、增殖的影响

目的探讨槲皮素（quercetin）对人肝癌HepG2细胞及稳定转染HBX基因的HepG2细胞（HepG2-X）增殖、侵袭力的影响，并探讨其可能的机制。方法体外培养HepG2及HepG2-X细胞，分别加入10，20，40，80μmolfL槲皮素进行处理后，用MTT实验检测细胞增殖抑制率，采用涂有Matrigel胶的Transwell小室模型对传代培养的HepG2细胞进行体外侵袭力检测。结果不同浓度槲皮素均能够抑制HepG2、HepG2-X细胞的增殖，且呈时间和剂量依赖性，各HepG2-X组细胞A值均明显高于HepG2细胞（P〈O．05），HBX对HepG2细胞具有促进增殖作用。Transwell试验结果显示，与空白对照比较，槲皮素处理组HepG2细胞侵袭能力明显下降，且呈浓度依赖性。结论槲皮素能够抑制肝癌HepG2细胞的增殖、侵袭力，HBx在槲皮素的干预下能促进HepG2细胞的增殖作用。     

转染人livinα基因对Jurkat细胞增殖及凋亡的影响

目的：研究人livinα基因表达对Jurkat细胞增殖、凋亡的影响。方法基因转染获得稳定表达livinα的Jurkat细胞克隆（Jurkat/livinα）;MTT法测定细胞增殖,流式细胞仪分析细胞凋亡率,通过观察细胞生长和凋亡情况,探讨livinα对Jurkat细胞增殖及凋亡的影响;RT-PCR检测细胞中livinα和caspase-3 mRNA的表达。结果Jurkat/livinα组livinαmRNA表达高于对照组（Jurkat细胞组）（P＜0.05）,转染后caspase-3 mRNA受到抑制,表达减弱,细胞生长曲线显示Jurkat/livinα组细胞生长速度增快,倍增时间缩短9-10 h（P＜0.05）,细胞凋亡率计算显示Jurkat/livinα组细胞凋亡率较Jurkat细胞组明显减少（P＜0.01）。结论 livin α基因能促进Jurkat细胞生长,可能通过抑制细胞凋亡而在急性T淋巴细胞白血病发生发展中起重要作用,有望成为白血病治疗的新分子靶点。     

迷迭香酸联合槲皮素对人肝癌HepG2细胞增殖和迁移的影响

目的探讨迷迭香酸联合槲皮素对人肝癌 HepG2细胞增殖、侵袭力的影响,并探讨其可能的机制。方法以不同浓度迷迭香酸(12.5、25.0、50.0和100.0 μmol/L)和槲皮素(12.5、25.0、50.0和100.0 μmol/L)单药及二者联合用药处理 HepG2细胞 36 h,用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测细胞增殖,划痕实验检测细胞迁移能力,蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白 E-钙黏蛋白(E- cad)及N-钙黏蛋白(N-cad)的表达情况。结果槲皮素和迷迭香酸单药均能使细胞活力降低,二者联合用药对细胞活力抑制率更加显著,且呈剂量依赖性( P＜0.05)。 25 μmol/L迷迭香酸组及25 μmol/L槲皮素组划痕愈合距离分别为( 11.35±2.37)mm、(11.46±     

脂联素对高糖条件下视网膜血管内皮细胞增殖、迁移和管腔形成的作用

目的：观察脂联素(APN)对高糖培养条件下恒河猴脉络膜视网膜血管内皮细胞(RF/6A细胞)增殖、迁移和管腔形成的影响。

方法：将体外培养的RF/6A细胞随机分为空白对照组(正常培养基培养)、甘露醇对照组(含20mmol/L甘露醇的培养基培养)、高糖组(含25mmol/L D-葡萄糖的培养基培养)和高糖+APN组(含25mmol/L D-葡萄糖+10μg/mL APN的培养基培养)。分别采用CCK-8法检测细胞增殖,Transwell小室检测细胞迁移,基质胶(Matrigel)法检测细胞管腔形成能力。

结果：空白对照组与甘露醇对照组细胞增殖率(100.00%±0.00% vs 99.09%±0.46%)、迁移数(121.60±6.02个 vs 119.60±9.39个)及管腔形成数(12.11±0.84个 vs 12.22±0.96个)均无差异(P>0.05)。高糖组细胞增殖率(71.42%±2.29%)明显低于空白对照组和甘露醇对照组,细胞迁移数(144.20±9.65个)和管腔形成数(16.00±2.90个)均明显高于空白对照组和甘露醇对照组(P<0.05)。高糖+APN组细胞增殖率(90.87%±1.68%)明显低于空白对照组和甘露醇对照组,明显高于高糖组; 细胞迁移数(73.00±6.04个)和管腔形成数(7.89±0.38个)均明显低于空白对照组、甘露醇对照组及高糖组(P<0.05)。

结论：APN可以促进高糖条件下RF/6A细胞存活及增殖,抑制细胞迁移和管腔形成,提示APN对高糖导致的RF/6A细胞损伤具有一定的保护作用,抑制病理刺激条件下的血管生成。     

视网膜色素上皮细胞表达IL-1β和IL-6与细胞自噬的关系

目的：研究细胞自噬在缺氧条件下视网膜色素上皮(RPE)细胞表达炎性因子IL-1β和IL-6中的作用。

方法：将体外培养的人RPE细胞系随机分为缺氧组、3-甲基腺嘌呤(3-MA)+缺氧组、氯喹(CQ)+缺氧组和对照组。培养24h后采用Western blot法检测各组细胞的自噬关键蛋白微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)、Beclin-1及p62的相对表达水平; 采用ELISA法检测各组细胞上清液中IL-1β和IL-6的浓度。

结果：缺氧组IL-1β和IL-6的浓度明显高于对照组、3-MA+缺氧组和CQ+缺氧组(均P<0.01)。缺氧组细胞中LC3B-Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1的相对蛋白表达量均明显高于对照组和3-MA+缺氧组,缺氧组中LC3B-Ⅱ/Ⅰ的相对蛋白表达量低于CQ+缺氧组(均P<0.01)。缺氧组细胞中p62相对蛋白表达量明显低于对照组、3-MA+缺氧组和CQ+缺氧组(均P<0.01)。

结论：缺氧使RPE细胞LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1表达增强,p62表达减弱,并促进细胞分泌IL-1β和IL-6,自噬抑制剂3-MA和CQ能够减少RPE细胞表达IL-1β和IL-6。     

血管内皮细胞生长因子抑制剂对视网膜血管内皮细胞自噬的促进作用

目的　观察血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）抑制剂对小鼠视网膜血管内皮细胞（retinal vascular endothelial cells,RVECs）自噬水平的影响。方法　将RVECs随机分为五组:正常对照组、缺氧对照组、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）组、VEGF抑制剂（anti-VEGF）组和3-MA+anti-VEGF组。采用Western blot法检测RVECs中两种自噬标志蛋白微管相关蛋白1 轻链 3 （LC3）及Beclin-1的表达;计算绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）阳性斑点细胞占比;透射电子显微镜下观察细胞内形成的自噬体的超微结构。结果　正常对照组、缺氧对照组、3-MA组、anti-VEGF及3-MA+anti-VEGF组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ分别为0.182±0.125、0.587±0.101、0.309±0.151、0.914±0.037及0.585±0.098;Beclin-1分别为0.205±0.035、0.590±0.120、0.425±0.082、0.842±0.087及0.607±0.022;GFP阳性斑点细胞比例分别为17.107%±3.521%、90.278%±2.684%、82.591%±4.490%、94.798%±1.760%及89.472%±3.764%。与正常对照组相比,缺氧对照组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1蛋白表达增高,GFP阳性斑点细胞的比例增加（均为P<0.05）,同时自噬体增多。与缺氧对照组相比,3-MA组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平及GFP阳性斑点细胞比率降低（均为P<0.05）,同时自噬体减少;anti-VEGF组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平及GFP阳性斑点细胞比率升高（均为P<0.05）,同时自噬体增多。与anti-VEGF组相比,3-MA+anti-VEGF组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平及GFP阳性斑点细胞比率降低（均为P<0.05）,同时自噬体减少。结论　VEGF抑制剂对缺氧状态下视网膜血管内皮细胞的自噬水平有促进作用。