H9N2禽流感病毒反向遗传系统的构建和鉴定

目的 建立H9N2亚型禽流感病毒反向遗传系统,为人禽流感疫苗研制以及传播和致病机制等方面的研究提供技术平台.方法 使用RT-PCR方法获得禽流感H9N2亚型病毒A/Guangzhou/333/99(H9N2)的8条全长基因节段,然后克隆到双表达载体pCI-pol Ⅰ中,获得H9N2禽流感病毒的8个基因节段的8质粒系统.将构建好的8质粒共转染293T细胞后,收获上清接种鸡胚,然后对鸡胚尿囊液进行鉴定;对拯救的病毒进行鉴定.结果 8质粒系统转染293T细胞后可以成功拯救出H9N2禽流感病毒,血凝效价可达到29/50μl,生长特性与野生型病毒类似.结论 成功建立了H9N2禽流感病毒反向遗传系统.     

用于荧光定量检测流感病毒RNA质控品的制备及质控图的绘制

目的 应用自制流感病毒RNA室内质控品,绘制Levey-Jennings质量控制图.方法 选取近期的流感病毒流行代表株,提取RNA后10倍系列稀释（10-1 ～ 10-8）,取不同稀释度的RNA做RT-PCR荧光定量检测,每个稀释度平行做三孔,根据检测的平均Ct值选取高Ct值和低Ct值对应稀释度的RNA,连续检测20次,计算均值（x）和标准差（s）,应用Excel软件绘制Levey-Jennings质控图.结果 用Excel绘制出三种亚型流感病毒的Levey-Jennings质控图,三种亚型RNA质控品均在警戒线内.结论 三种亚型RNA质控品稳定性较好,制备简单,质控图绘制方便,适用于PCR检测实验室对流感病毒的室内质控.     

小鼠感染流感病毒后可抵抗致死性流感病毒攻击的研究

目的 BALB/c小鼠初次感染流感病毒(A/California/7/2009(H1N1)(pCA07)和A/Guangzhou/333/99(H9N2)(GZ333))后,用流感病毒鼠肺适应株A/PR/8/34(H1N1)(PR8) 10倍致死剂量攻击,观察攻毒后小鼠的反应.方法 BALB/c小鼠150只,分成3组,空白对照组PBS滴鼻,实验组分别感染甲型H1N1流感病毒pCA07和禽源H9N2病毒GZ333；感染56 d后用10倍致死剂量的鼠肺适应株流感病毒PR8攻击两个实验组和对照组小鼠,比较PR8病毒攻击后,病毒载量和抗体水平,以及对小鼠存活率的影响.结果 感染过pCA07和GZ333的小鼠在致死病毒PR8攻击后全部存活,并分别在病毒攻击6d和9d后小鼠肺组织中检测不到攻击病毒.对初次感染病毒的抗体水平在病毒PR8攻击后迅速升高,在保持初次感染病毒抗体的同时能够产生针对PR8病毒的抗体.结论 不同亚型流感病毒感染小鼠后可以提供交叉保护.     

双价肾综合征出血热纯化疫苗人群接种安全性与免疫学效果评价

1996年对浙江天元生物药业股份有限公司 (天元公司 )研制的肾综合征出血热 (ＨＦＲＳ)双价灭活疫苗进行观察 ,安全性及免疫学效果均较好 ,但Ｉ型中和抗体阳转率稍低[1 ] 。2 0 0 1年 8～ 9月 ,在江苏省金坛市进行了天元公司生产的ＨＦＲＳ双价纯化疫苗临床研究 ,观察人群接种反应与免疫效果 ,并为其确定基础免疫程序及向人群大规模推广应用提供科学依据。一、材料与方法1.疫苗 :双价ＨＦＲＳ纯化疫苗由天元公司生产 ,以沙鼠肾细胞为培养基质 ,所用毒株为Ｚ1 0 (Ⅰ型 )和Ｚ37(Ⅱ型 ) ,经浓缩、灭活、纯化制成。观察疫苗批号为 2 0 0 0 0 5 0 …     

不同亚型禽流感病毒红细胞凝集特性分析

目的了解不同亚型禽流感病毒与不同动物来源红细胞的凝集特性,为流感环境样本监测工作选择更适宜的检测用红细胞。方法选取2009-2016年我国禽流感环境监测中分离到的不同亚型的禽流感毒株,采用红细胞凝集试验,选用5种动物红细胞(鸡、火鸡、豚鼠、马和绵羊)进行检测;应用流式细胞仪检测不同动物红细胞表面唾液酸受体的表达及类型,通过氨基酸序列分析病毒血凝素蛋白受体结合区(receptor binding domain,RBD)的特征。结果本研究共检测了14种亚型的28株禽流感病毒。结果显示所有毒株均能与火鸡和豚鼠红细胞发生凝集,其余红细胞均出现不能与某些毒株产生凝集的现象;其中1株H9N2(A/环境/安徽/43762/2015)毒株与鸡红细胞不产生凝集反应;1株H1N1(A/环境/山东/76972/2014)和2株H9N2(A/环境/重庆/79449/2014和A/环境/安徽/43762/2015)毒株与马红细胞不产生凝集反应;2株H9N2(A/环境/重庆/79449/2014和A/环境/安徽/43762/2015)和2株H13N8(A/环境/青海湖/166/2012和A/环境/青海湖/13/2012)毒株与绵羊红细胞不产生凝集反应。流式检测结果显示在火鸡、鸡和豚鼠红细胞表面可检测到两种类型唾液酸受体α2,3和α2,6,但两种受体表达比例不同;马和绵羊红细胞表面唾液酸受体只检测到表达α2,3。序列分析提示病毒RBD关键区域的氨基酸替换可能是影响病毒红细胞结合特性的重要因素。结论在禽流感病毒检测中,火鸡和豚鼠红细胞在红细胞凝集试验中敏感性最好。不同来源的红细胞其受体表达及类型会显著影响不同亚型禽流感病毒的凝集反应,同时RBD关键区域的氨基酸变化也会影响病毒与不同红细胞的结合。     

流感疫苗接种与格林巴利综合征

一直以来,疫苗被认为是在病原体侵袭人类时减少发病和死亡的重要的干预手段.对流感病毒感染的预防也不例外,每年季节性流感疫苗的接种以及对流感大流行疫苗的研制一直是全球各个国家的重要公共卫生策略.     

H5N1禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因在杆状病毒中的共表达

目的构建共表达H5N1禽流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白的杆状病毒表达系统。方法利用PCR方法分别扩增A/Hubei/1/2010(H5N1)病毒的HA和NA基因,克隆至经改造带有对虾白斑综合病毒(WSSV)早期启动子iel的mpFastBac Dual载体,构建mpFast Bac-HA-NA表达质粒,转化DH10Bac感受态细胞,用获得的Bacmid-HA-NA穿梭质粒转染sf9细胞,获得重组杆状病毒Bac-HA-NA;提取重组杆状病毒Bac-HA-NA的DNA并使用PCR方法检测;利用Western blot检测HA和NA表达,并分别检测重组杆状病毒Bac-HA-NA红细胞凝集能力和神经氨酸酶活性。结果经PCR鉴定,构建的质粒Bacmid-HA-NA正确;Western blot检测表明Bacmid-HANA能在sf9细胞中有效表达HA和NA蛋白,生物活性检测表明Bac-HA-NA能引起红细胞凝集并具有神经氨酸酶活性。结论获得了能同时表达禽流感病毒HA和NA的重组杆状病毒Bac-HA-NA,为进一步研究流感疫苗奠定了基础。